本文是一篇医学论文，本课题利用HRM技术在一个反应管、一次反应中同时鉴别五种人畜共患的巴贝斯虫，而且从扩增靶序列到结果分析是一种全自动化的过程，结果直观可见，反应时间短（约60min）；
第一章 前言
1.1 人类巴贝斯虫病概
1.1.1巴贝斯虫
巴贝虫（Babesia）是一种血液原虫，隶属于梨形虫目、巴贝斯虫科、巴贝斯虫属[1]。巴贝斯虫与疟原虫（Plasmodium）、弓形虫(Toxopla-ma）和隐孢子虫（Cryptosporidium）是顶复亚门中人畜共患的主要病原体[2]。大多数巴贝斯虫属虫体只有1-5 μm长，寄生于宿主红细胞时呈圆点状、梨形、环形或杆形[3]。迄今为止，在野生和家养动物中已发现100多种巴贝斯虫，在世界范围内对畜牧业产生了重大的经济影响[4]。此前被认为只感染动物的巴贝斯虫已被证明会对免疫系统较弱的人构成威胁，并由于全球连通性的增强而扩散到非流行地区。其中，有六种巴贝斯虫是众所周知的人类巴贝斯虫病的罪魁祸首，包括田鼠巴贝斯虫（B. microti）、分歧巴贝斯虫（B. divengens）、邓肯巴贝斯虫（B. duncani）、粗糙巴贝斯虫（B. crassa-like）、莫氏巴贝斯虫（B. motasi）、猎户巴贝斯虫（B. venatorum）[5, 6]。
巴贝斯虫通过寄生哺乳动物红细胞赖以生存和繁殖，通过寄生虫蛋白和宿主细胞表面的多种相互作用入侵宿主红细胞，但这些相互作用尚未完全鉴定和表征[7-9]。蜱虫叮咬后进入人体血液的孢子的确切数量仍不清楚，因此很难评估红细胞入侵的相对效率。然而，根据观察B. divergens的体外培养模型，并不是所有的寄生虫都是成功的入侵者。寄生虫似乎可以控制被入侵红细胞的数量，这可能是一种保护宿主的方法，并确保宿主在大量红细胞被入侵时不受大量溶血的影响而存活下来[10]。顶复门原虫的名字来源于一个独特的顶端复合体的存在，该复合体由在入侵中发挥关键作用的细胞器组成。它们包括微丝、棒状体和致密颗粒[8]。研究表明，巴贝斯虫侵入红细胞的过程极其迅速并且在秒的数量级[11]。与疟原虫不同，巴贝斯虫不入侵其他宿主细胞。这种特异性意味着红细胞上存在被寄生虫的互补分子所识别的受体。用不同蛋白水解酶处理的人红细胞仍然支持寄生虫入侵，表明寄生虫有多种进入红细胞的途径[12]。
1.2 人类巴贝斯虫病诊断技术研究进展
1.2.1 病原学检测技术
血涂片镜检是目前临床检测人类巴贝斯虫病最常用的病原学检测方法，也被认为是确诊巴贝斯虫病的金标准[90, 91]。通过显微镜观察吉姆萨染色的血涂片，凭靠镜下观察到的红细胞内寄生的巴贝斯虫虫体，并结合临床特征以及旅游史对疾病做出确诊。然而，感染人类的几种巴贝斯虫不仅在形态上与疟原虫相似，而且不同亚种间彼此相似[92]。裂殖子排列为四分体是巴贝斯虫感染的特异表现，但很少被发现。在疾病的早期阶段，寄生虫血症通常低于1%，在显微镜检查中很容易被误诊为假阴性[93]。因此，连续多次采集的血液涂片必须在至少300个显微镜视野下进行研究，以避免忽视寄生虫[94]。因此，基于形态学的巴贝斯虫的分类和诊断对于显微镜学家来说是一个相当大的挑战。此外，如果样本数量较多时，血涂片镜检费时费力，因此该方法一般不用于流行病学调查，只应用于临床少量样本的检测。总之，血液涂片镜检是诊断的第一步，应进行额外的评估，以提高检测的敏感性和特异性。
寄生虫的培养可分为动物接种(体内)和人工培养基培养(体外)两种类型。寄生虫培养可以帮助鉴定无症状或低寄生虫血症的个体，确定寄生虫的系统发育关系并能进行抗寄生虫药物的敏感性测试。在显微镜下出现可见的寄生虫血症后，动物接种培养期通常需要7-10天[95]。金黄地鼠、切除脾脏的犊牛和沙鼠以及SCID(严重联合免疫缺陷症)小鼠等动物模型已被用于检测巴贝斯虫的感染，如接种B. duncani、B. divergens和B. microti [96] [97]。此外，M199、NCTC-135和RPMI 1640等培养基也被证明可以培养牛巴贝斯虫(B. bovis)和B. divergens [98-100]。邓肯巴贝斯虫的长期体外培养体系也被成功建立[85, 101]。然而，寄生虫培养虽已用于诊断动物巴贝斯虫病，但由于很耗时，需要培养一周以上，且无法给出精确的鉴别结果，所以一般不用于人类巴贝斯虫感染[95]。
第二章 基于qPCR-HRM的巴贝斯虫鉴别检测技术
2.1 主要材料与仪器
2.1.1主要材料
DH5α 化学感受态细胞购自南京诺唯赞生物；PrimeSTAR® Max DNA Polymerase、DL5000 DNA Marker、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 购自宝生物（大连）；Zymoclean Gel DNA Recovery Kit 购自 Zymo 公司；限制性内切酶 Hind III-HF、Not I-HF 购自 New England Biolabs；QIAamp DNA Blood Mini Kit 购自 QIAGEN公司；Premix Taq DNA聚合酶 购自大连宝生物； Forget-me-NotTM qPCR Master Mix 购自Biotium公司。Plasmid Miniprep Kit试剂盒购自OMEGA公司。
2.1.2主要仪器
生物安全柜：苏净安泰 BSC-1000IIA2；高速离心机：德国艾本德，5420-R；高压灭菌锅： LMQ.C-80EJ 压力蒸汽灭菌器；超微量分光光度计：美国赛默飞世尔 NanoDrop 2000； PCR 仪：（美国）伯乐 Bio-Rad，T100；凝胶电泳仪：北京六一生物，DYY-6 电泳仪；紫外凝胶成像仪：美国 ProteinSimple，专业级凝胶成像仪；恒温摇床：上海知楚仪器，ZQZY-88BN； Rotor-Gene Q（德国 Qiagen 公司），Nanodrop 2000（美国 Thermo Scientific 公司）。恒温混匀仪：杭州 ALLSHENG，MS-100-C；
2.1.3实验动物
两月龄SPF级金黄地鼠 40 只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重（100 ±2 0）g。六月龄健康绵羊购自中国甘肃省景泰县。
2.2 方法
2.2.1感染动物模型的建立
使用显微镜和PCR检测，绵羊为螺旋体感染阴性。实验前一个月对绵羊进行脾切除手术，并每天对伤口消毒处理并注射抗生素防止绵羊感染细菌。将保存在液氮中的B. motasi Hebei虫株的混悬液在37°C水中快速摇晃解冻，然后给绵羊颈部备皮，通过颈静脉将50ml混悬液（约1×109个感染的红细胞）注射到脾切除的绵羊体内。绵羊感染7天后通过耳缘静脉采血制备血涂片，在对血液涂片进行Giemsa染色后，通过显微镜计算寄生虫血症。每张血涂片计数约3000个红细胞（RBCs），以计算感染红细胞的百分比。通过颈动脉采血收集不同寄生虫血症的全血。
同样，在37°C水浴中快速复苏冷冻的B. duncani后，分别给五只金黄地鼠腹腔注射200μl的混悬液（约2.0×106感染红细胞）。金黄地鼠感染后第四天通过后腿内侧静脉采集血液制备血涂片，观察寄生虫血症的水平。对金黄地鼠使用异氟烷麻醉后，通过心脏采血将多只金黄地鼠的不同寄生虫血症的全血收集到EDTA抗凝管中。
2.2.2纯化巴贝斯虫的裂殖子
① 将感染巴贝斯虫的动物全血离心，3500rpm离心10min,弃掉上清。
② 加入3倍红细胞沉淀体积的红细胞裂解液，颠倒混匀使红细胞充分裂解，并转入15ml离心管冰上静置10min。然后12000rpm离心15min，缓慢吸取弃掉上清。
③ 加入沉淀的10倍体积的PBS，颠倒混匀，然后12000rpm离心15min，缓慢吸取上清并弃掉。
④ 加入沉淀的10倍体积的PBS，颠倒混匀，然后12000rpm离心15min，缓慢吸取上清并弃掉。
⑤ 加入沉淀的5倍体积的PBS，颠倒混匀，然后12000rpm离心15min，缓慢吸取上清并弃掉。
⑥ 最后一次离心完成后，加入等体积的PBS，吹打混匀后将混悬液转移至1.5mlEP管，然后12000rpm离心15min，弃掉上清。
⑦ 做好标记后放入-20℃保存。
第三章 检测B. duncani的巢式qPCR方法的建立 ........ 39
3.1 材料 ........................... 39
3.1.1 主要仪器 ................................ 39
3.1.2 主要试剂 .............................. 39
讨论
显微镜观察吉姆萨染色的血涂片中寄生于红细胞的巴贝斯虫被认为是诊断巴贝斯虫感染的金标准[90, 91]。但吉姆萨染色的血涂片中B. duncani滋养体和裂殖子的形态特征与B. microti [44]无明显区别。因此，将巴贝斯虫与其他梨形虫[92]区分开来具有一定的挑战性。此外，当血液寄生虫血症< 0.1 %时，就算观察数百个视野也很难检测到寄生虫。在如此低的水平下，正确的诊断很大程度上依赖于具有专业知识的高技能人才。因此，基于形态学的巴贝斯虫感染的分类和诊断对于显微镜工作者来说是一个相当大的挑战。
与目前的金标准方法( ME )和巢式PCR相比，巢式qPCR方法的特异性和灵敏度都有所提高。我们新建立的巢式qPCR检测方法与其他人畜共患巴贝斯虫亚种，如B. divergens、B. microti、B. crassa和 B. motasi
