本文是一篇医学论文,本研究通过对人用疫苗基质Vero细胞上培养CV-A10病毒,对其进行超滤浓缩和分离纯化后获得CV-A10的EP、FP病毒颗粒,确定CV-A10天然病毒中空实壳颗粒的比例及二者在CsCl梯度中的密度。
第一章 材料与方法
1 实验材料
1.1 细胞
病毒培养、滴定和中和抗体检测所用细胞人横纹肌瘤细胞(Human rhabdomyosarcoma cells,RD)、非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney cell,Vero) 等细胞,均由武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究一室(病研一室)保存。
1.2 病毒
CV-A10候选疫苗毒种为CV-A10-L12/JZ/2015(简称CV-A10-L12),2015年湖北荆州HFMD患儿临床样品RD细胞分离,以Vero细胞适应株序列构建感染性cD NA,在Vero细胞获得候选疫苗株。致死攻毒小鼠适应株为CVA10-L7-P4-P5+R5 (CV-A10-M14),母株为荆州CV-A10-R001/JZ/2015 (RD细胞分离株)。中和毒株为CV-A10-R97/XY/2017, 以2017年荆州HFMD患儿临床样品中RD细胞分离。以上毒种均由武生所病研一室培养保存。
1.3 实验动物
昆明鼠:1、12、14日龄,每组一窝(10只/窝);Balb/c鼠:6-8周龄,雌性,均由武生所实验动物中心提供。
2 实验方法
2.1 细胞或病毒培养及检定
2.1.1细胞培养及传代
取出放置于37℃,5% CO2孵箱中已长满的Vero或RD细胞的T75培养瓶,在超净台中打开瓶盖,倒掉培养基,用移液枪加入5 mL无菌的0.01 M PBS溶液并重复冲洗2遍,洗掉残留的培养基后,加入3 mL胰酶替代物Tryple Select (约占培养液体积20%),置于37℃孵箱中2-3分钟。
在显微镜下观察细胞与细胞之间出现间隙且细胞变圆缩后,轻拍瓶身侧面,使贴壁细胞从瓶壁上消化下来。加入5 mL含10%新生牛血清的DMEM或MEM培养基,多次吹打并冲洗瓶壁上残留的细胞,吹打混匀后按瓶内液体体积1:5传代,可传至新瓶或旧瓶,弃去多余细胞。在加入细胞的新T25或T75瓶中加入5 mL或20 mL培养基,置于37℃,5% CO2孵箱中培养。
2.1.2病毒培养及传代
待T25瓶中细胞汇合度至90%时,在病毒间生物安全柜中打开瓶盖,倒掉培养基,用移液枪加入5 mL无菌的0.01 M PBS溶液并重复冲洗2遍,洗掉残留的培养基。随后加入1 mL不含血清的DMEM或MEM维持液,再按MOI = 0.01加入所需的病毒体积,置于37℃,5% CO2孵箱吸附一小时后,补加4 mL维持液,置于孵箱培养,每天观察并记录CPE。
第二章 CV-A10灭活疫苗组分分析
1 实验结果
1.1 CV-A10病毒EP、FP分离纯化及其蛋白分析
通过培养10层细胞工厂的Vero细胞,接种CV-A10-L12病毒,收获后病毒液通过100 kD膜包进行浓缩。浓缩后通过20%蔗糖垫底离心纯化和CsC l密度梯度离心分离EP和FP,配制CsCl的密度为1.30 g/mL。具体方法见2.2。CsCl离心条带见图2.1。将CsCl离心管中的EP和FP条带收集后,使用阿贝折光仪进行EP和FP的密度测定,测得EP的密度为1.29 g/mL, FP的密度为1.32 g/mL。
2 小结
通过对CV-A10病毒的扩大培养、浓缩纯化等操作分离得到CV-A10病毒的两种病毒颗粒,分别为EP、FP。
通过CsCl等密度梯度离心得到了EP和FP两种病毒颗粒的CsCl密度,通过SDS-PAGE、WB等实验方法确定了EP、FP在全病毒颗粒中的占比,鉴定了病毒结构蛋白及宿主细胞蛋白的成分。这些比较深入的研究对了解病毒的结构、功能特性及生物学性质奠定了良好的基础。
电镜观察EP、FP颗粒使得对病毒颗粒的了解更加直观,EP为空心颗粒,FP则为较为致密的实心颗粒。灭活前后的病毒颗粒电镜图也进一步说明,灭活前后的病毒颗粒完整,大小相同,几乎无差别,说明该灭活方法对病毒较为温和,并没有破坏病毒的形态结构,对病毒的功能结构影响较小。
由EP和FP的纯度分析也进一步验证了纯化步骤的质量较高,说明该套纯化方法比较适用于病毒颗粒的分离和纯化。
第三章 CV-A10灭活疫苗体液及细胞免疫原性研究 .................. 59
1 实验结果 ................................... 59
1.1 CV-A10灭活疫苗体液免疫 ......................... 59
1.1.1免疫原性试验方案 ................................. 59
1.1.2免疫原性实验结果分析 .................... 60
第四章 14日龄昆明鼠主动免疫-攻毒模型建立及候选疫苗体内效力评估 .......... 69
1 实验结果..................................... 69
1.1 CV-A10 攻毒株选育 ............................ 69
1.2 CV-A10-M14腹腔感染12/14日龄昆明鼠 ........................ 69
1.3 攻毒株CV-A10-M14 LD50测定 ................................... 70
第五章 总结与讨论.................................. 88
1 总结.................................... 88
2 讨论.................................. 89
第四章 14日龄昆明鼠主动免疫-攻毒模型建立 及候选疫苗体内效力评估
1 实验结果
1.1 CV-A10 攻毒株选育
经过前期本实验室将CV-A10-L7-R5-P5原始RD细胞株在日龄渐大乳鼠中逐代适应,RD细胞隔代扩增,筛选致死强毒力攻毒株。但由于该病毒在RD细胞上滴度低,低感染毒量只能稳定致死12日龄小鼠。为获得可以致死14日龄的小鼠动物模型,将病毒体积浓缩35倍以提升病毒感染剂量,且采用接种容积高的腹腔注射(i.p. route)途径以提高致死率。所获浓缩攻毒株记为CV-A10-M14, 测得其病毒滴度为1 × 109.5 CCID50/mL。
1.2 CV-A10-M14腹腔感染12/14日龄昆明鼠
将CV-A10-M14以高感染剂量(9.5 × 108 CCID50/只)通过腹腔注射方式感染12、14日龄昆明鼠(300 μL/只,10只/组) ,12和14日龄昆明鼠发病率和死亡率均为100%。
感染CV-A10-M14病毒的12和14日龄乳鼠均出现精神萎靡、体重下降、双侧后肢瘫痪的现象。实验组中12和14日龄乳鼠在感染后第3天各死亡1只,在第5天分别死亡7、5只,在8天内实验组乳鼠全部死亡。注射MEM维持液的对照组小鼠在观察期14天内均无发病和死亡。在整个实验观察周期内同时记录乳鼠的存活率及临床评分。
第五章 总结与讨论
1 总结
(1) 本研究通过对人用疫苗基质Vero细胞上培养CV-A10病毒,对其进行超滤浓缩和分离纯化后获得CV-A10的EP、FP病毒颗粒,确定CV-A10天然病毒中空实壳颗粒的比例及二者在CsCl梯度中的密度。通过电镜分别观察EP、FP的颗粒灭活前后形态,通过SDS-PAGE、Western blot对不同颗粒的结构代表组成进行定性定量实验,以特异性抗体鉴别了病毒颗粒蛋白,区别了宿主细胞残留蛋白,并对候选疫苗的纯度进行了分析。研究发现,CV-A10病毒颗粒比例为EP:FP约为40% : 60%,密度分别为1.29 g/mL及1.32 g/mL,CV-A10灭活疫苗(EP、FP混合样)的纯度高达92%。
(2) 本研究通过对6-8周龄Balb/c小鼠进行免疫原性研究,将小鼠分为0.5 μg和2.0 μg剂量组,同时设置阴性对照组Al(OH)3。分别在0、14天进行初次免疫和加强免疫,分别在14、28天进行采血进行中和抗体水平的鉴定实验。0.5 μg和2.0 μg剂量组中和抗体在初免和加强免疫后阳转率分别为60%和100%,加强免疫后中和效价有明显的提升,两个剂量组的血清中和抗体水平相似,平均中和效价均为48。经过免疫持久性的检测,发现CV-A10候选疫苗2针免疫后,小鼠血清中的中和抗体效价可以至少持续至第8周(56天)。研究发现,接种疫苗后,小鼠的临床评分为0,无不适现象与临床症状,说明小鼠对CV-A10灭活疫苗的耐受性良好。
参考文献(略)