本文是一篇医学论文，在本研究中，我们选择了卵泡中的细胞体外培养 TC 和 GC 细胞，并研究了其对繁殖相关类固醇激素合成的影响。然而，它不能完全代表整个卵泡的体内微环境。
第一章 文献综述
1. 颗粒细胞和膜细胞的形成及作用
颗粒细胞和膜细胞是存在于卵泡中的两种类固醇生成细胞，在卵泡发育过程中发挥着十分重要的作用。颗粒细胞主要通过两个途径发挥作用，一是通过细胞凋亡过程对卵泡的闭锁进行调控，二是以分泌细胞因子、激素以及蛋白的形式来调控卵泡的生长和发育；膜细胞的作用主要体现在支撑卵泡发育，分泌雄烯二酮从而促进颗粒细胞合成雌二醇这两个方面[15-16]。
作为卵泡中的类固醇生成细胞，颗粒细胞可分泌雌激素和孕酮这两种类固醇激素，膜细胞所分泌的类固醇激素则为雄激素和孕酮。在类固醇相关蛋白 3β-HSD、CYP11A1 和 StAR 作用 下， 颗粒细 胞与 膜细 胞都能 产生 孕酮。 在CYP17A1 的作用下，内膜细胞将孕酮转化为雄烯二酮，后者进入颗粒细胞后在CYP19A1 的作用下进而又转化为雌二醇[17]。其中，内膜细胞分泌雄烯二酮的过程由 LH 通过 LHR 促进 CYP17A1 的表达来调控，颗粒细胞合成雌二醇的过程由 FSH 通过 FSHR 促进 CYP19A1 的表达来完成[18]。类固醇激素在雌性动物生殖系统的生长发育中起着关键性作用，同时类固醇激素也对神经、乳房等组织器官的生长发育产生一定的影响[19]。
1.1 颗粒细胞的来源及在卵泡发育中的作用
卵巢与睾丸发育不同，处于生育前这一生殖段阶时，卵巢分化反应的活动范围比较窄，卵巢在颗粒细胞分化的早期阶段外形并未显著改变[20-21]。因此，对颗粒细胞起源的研究的难度较大。很多研究者采用了标记法和谱系跟踪法深入研究了雌性动物卵巢的发育过程，以便于更好的了解和揭示更复杂的颗粒细胞分化途径。采用谱系跟踪的方式进行试验的结果表明，成年雌性动物体内卵巢中的颗粒细胞也许并非起源于正常的细胞发育[22]。孕期雌性动物卵巢中的FOXL2 阳性球菌体在出生时便会被迅速激发，而颗粒细胞在分娩过程中仅出现在雌性动物的卵巢髓质中，而非出现在雌性动物卵巢皮层细胞质之中，因此，能够推断孕期雌性动物卵巢中的卵泡颗粒细胞也许来源于前体细胞[23]。
2 N-乙酰半胱氨酸的抗氧化作用
NAC 于 1963 年首次以黏液溶解剂的形式被应用到人体肺部疾病的治疗中[77]。NAC 于 1978 年正式被认证为对乙酰氨基酸（APAP）的口服解毒剂[78]。NAC 于 2004 年以静脉注射液的方式被应用于预防出血膀胱炎的治疗中。数年来，专家学者对 NAC 抗氧化作用方面的研究力度不断增加。Sun 等人的研究结果表明，肝脏缺血再灌注损伤（IRI）期间内质网发生氧化应激和组织损伤，患者在接受系统的 NAC 临床治疗后，有效缓解了因 IRI 因素引起的肝脏疾病，提升人体中 GSH 的水平的同时也降低了 ROS 的水平与丙二醛（MDA）含量[79]。Luis 等人研究结果证实，NAC 以降低 H2O2 的反应作用达到对体外培养的营养不良肌细胞的氧化应激的抑制效果[80]。
Mahdi 等人[81]研究结果证明，NAC 作为一种有效的抗氧化剂能补偿对壬基苯酚（p-NP）诱导的睾丸组织氧化应激，且弥补了 p-NP 对睾丸组织、精子参数、血清和睾丸 MDA 以及睾酮水平的损伤。此外，NAC 治疗可以调节大鼠耳蜗中卡那霉素诱导的包括参与细胞氧化反应与炎症反应的基因表达，且该变化与 NAC 能清除自由基、减少炎症反应相关[82]。上述研究表明：NAC 的抗氧化作用与其能直接清除自由基和间接增加 GSH 合成具有关系。
从相关研究人员的研究结果中得出，NAC 具有抗凋亡作用。Abrigo 等人[83]的实践结果证实，小鼠 CLD 引发骨骼肌产生氧化应激反应和细胞凋亡现象，接受全面的 NAC 治疗能够有效减少骨骼肌的损伤和动物体内的活性氧含量，Caspase-9 与 Caspase-3 减少，Bcl-2 与 Bax 的表达水平趋于正常值。刘学忠等人[84]的实验结果证明：NAC 对镉的诱导作用能够有效降低 BRL3A 细胞凋亡的线粒体数量和死亡受体通路的反应效率。据 Li 等人[85]的研究得出：NAC 通过抑制 Caspase-3 的方式降低大鼠氧化应激反应能力，可能阻止动物海马体因辐射的诱导产生凋亡。NAC 对肺损伤大鼠的氧化应激和凋亡同样有保护的作用[86]。综上：NAC 的抗凋亡作用与其调控线粒体途径抑制细胞凋亡相关联。
第二章 褪黑素对绵羊 TC 增殖和类固醇激素生成的影响
2.1 材料与方法
2.1.1 实验仪器与设备
二氧化碳培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）、超净工作台（SW-CJ-1FD，苏净安泰）、倒置显微镜（Nikon，JAPAN）、台式高速离心机（TG16-WS，湘仪离心机）、全自动数显酶标仪、-80℃冰箱（海尔）、-20℃冰箱（美的）、4℃冰箱（美的）、电子恒温磁力搅拌器、高压灭菌锅、震荡仪、PCR 仪。
2.1.2 试剂及配制
2.1.2.1 试剂
DMEM/F12 1:1 液体培养基（1×）（含 5 mM/L 葡萄糖）（HyC lone 公司）、胎牛血清、双抗、Ⅰ型胶原酶、1×PBS、IBMX、胰蛋白酶 EDTA 消化液、牛血清白蛋白、褪黑素（sigma）、雄烯二酮 ELISA 检测试剂盒（Cloud-Clone Corp）；孕酮 ELISA 检测试剂盒（Cayman）；PrimeScript RT reagent kit（Takara）；SYBR Premix Ex Taq II（Takara）；EasyTaq PCR Super Mix（Transgen Biotech）。
2.1.2.2 配制溶液
（1）按照说明书将青/链霉素 1∶100 万单位的青霉素溶于 10 mL 超纯水，1∶80 万单位链霉素溶:10 mL 超纯水，再按照 1∶1 的体积均匀混合后，-20℃冰箱保存备用，使用时提前置于室温解冻然后按照 1∶1000 的比例加入细胞培养液或 PBS 中。
（2 ） PBS 缓冲 液： NaC l 2 g ， KCl 0.05 g， Na2HPO4·12H2O 0.725 g，KH2PO4 0.05g，PH=7.2-7.4，定容至 250 mL。高压灭菌后，加入青霉素 100IU/mL，链霉素 100 μg/mL，4℃备用。
（3）0.25%胰酶消化液：将 0.125 g 胰酶（Trypsin）溶于 50 mL 含有 0.1%EDTA 的 PBS 中，0.22 μm 滤膜过滤除菌，4℃储存，使用前 37℃孵育。
（4）胰岛素原液：称取 0.01g 重组人胰岛素，溶于 10 mL 的 0.02 mol/LHCl 溶液（36-38%的 HCl 17.2μL，加水至 10 mL 即成），配制成 1 mg/mL 的储存液，室温放置 24h 后，过滤分装，-80℃保存备用，使用时 1∶200 稀释。
2.2 实验方法
2.2.1 绵羊卵泡的分离
在兰州市忠华屠宰场采集绵羊卵巢，取出卵巢并立即将其放入装有 37°C 含有双抗的生理盐水溶液（0.9% NaC l+100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的保温瓶中，在 4 小时内带回实验室中，用生理盐水反复清洗卵巢，在 70%乙醇中冲洗 30 秒，然后用 37°C 生理盐水再次清洗 3 次。将处理好的卵巢置于含DMEM/F12 培养液的培养皿中，在体视镜下用异物针和精密镊直接剥离直径 2-5 mm 的卵泡，用含有双倍双抗的 DMEM/F12 冲洗三遍，目视检查卵巢是否存在一个较大的排卵前优势卵泡和几个其他从属卵泡。通过使用剪刀和镊子解剖从卵巢中仔细分离卵泡，并根据其外表面直径进行分类，外表面直径 12 mm 及以上的卵泡为排卵前优势卵泡，表面直径≤11 mm 的卵泡为次要卵泡。选取血管丰富，卵泡壁颗粒细胞没有明显凋亡现象的卵泡备用。
2.2.2 TC 的获取
在用实验针、眼科剪、玻璃细管轻轻分离剥开处理好的优势卵泡，暴露 TC，去除卵母细胞，小心冲洗分离吸去卵泡膜上多余的颗粒细胞及附属组织，将获得的卵泡内膜在培养皿中用用含有双抗的 PBS 清洗 3 遍，用小眼科剪小心将其剪成碎屑，用于下一步中卵泡内膜细胞的分离培养。
2.2.3 TC 的分离培养
在剪成泥状的卵泡内膜中加入胶原酶（Ⅳ型，1 mg/mL），37°C 消化 25 min。过滤组织碎屑，滤液离心弃上清，接种在 6 孔板中，每孔中加 2 mL10%胎牛血清、青霉素（5 μl/ml）和链霉素（10 μl/ml）的 DMEM/F12 培养基。于 37℃、5%CO2 的培养条件下培养 24 h，用 PBS 清洗每个孔中的细胞，在饱和湿度、37℃、5%CO2的条件下继续培养至合适的时间备用。
第三章 N-乙酰半胱氨酸（NAC）对绵羊 GC 增殖和类固醇激素生成的影响......................24
3.1 材料与方法............................. 24
3.1.1 实验仪器与设备................... 24
3.1.2 试剂及配制..................... 24
第四章 全文总结............................ 34
第三章 N-乙酰半胱氨酸（NAC）对绵羊 GC 增殖和类固醇激素生成的影响
3.1 材料与方法
3.1.1 实验仪器与设备
同实验 2.1.1
3.1.2 试剂及配制
3.1.2.1 试剂
Ｎ-乙酰半胱氨酸（NAC）（sigma）、雌二醇 ELISA 检测试剂盒（C
