3.1.2.2 配制试剂
添加 NAC 的培养液：常规培养液中添加 NAC，配置 NAC 浓度为 0， 50，100，500，1000 μmol/L 的培养液。于 4℃的冰箱中保存。
胰酶消化原代细胞，制备单细胞悬液，将 4×105/mL 的细胞悬液注入放有 8mm 圆形载玻片的 35 mm 细胞培养皿中，在 5% CO2、95%空气、37 ℃条件下，饱和湿度的培养箱中培养 24 h，细胞长至贴壁面 80%，取出细胞爬片，用 PBS冲洗 1 min×3 次，4%多聚甲醛固定 20 min 后，进行细胞免疫化学染色：固定好的细胞爬片，PBS 洗涤 1 min×3 次；0.4% Triton 通透细胞膜 10 min，PBS 洗涤 1min×3 次；即用型正常山羊血清封闭 30 min，除液，不用 PBS 洗涤；加入一抗FSHR 兔多克隆抗体（1∶100），4℃孵育，过夜；取出细胞爬片，PBS 洗涤 1min×3 次，加入二抗羊抗兔 IgG（H+L）（1∶100），室温，避光 1h，PBS 洗涤 1min×3 次，加入 1 mg/L 的 Hoechst33258，室温 5 min。PBS 代替一抗，阴性对照。荧光显微镜下观察。
第四章 全文总结
卵泡是卵巢的功能单位，由卵母细胞和一层被特化的体细胞-颗粒细胞包围的卵泡细胞组成。卵膜细胞层只包裹着生长中的卵泡。颗粒细胞通过分泌黄体酮和雌激素等性腺激素维持卵巢的生理功能[117-118]。Parrott 和 Skinner 的研究表明，颗粒细胞可以促进卵巢间质细胞募集以在卵泡周围形成膜细胞层，并且颗粒细胞分泌的抑制素可以诱导优势卵泡的成熟和雄烯二酮的产生[119-120]。这些发现表明，颗粒细胞可能为卵巢膜细胞的类固醇生成提供了一些必需的调节因子，如类固醇、生长因子、细胞因子和细胞外基质，并通过旁分泌调节维持 TC 合成雄激素的能力。相关的研究表明 GC 可以通过促进 StAR、Cyp11a1、Cyp17a1和 3β-HSD 的转录来增强分泌 LH 的能力，从而诱导 TC 中的雄激素合成。合成的雄激素在芳香酶的催化作用下增加膜细胞雄激素向雌激素的转化，这一过程涉及到多种调节因子以及受体的参与[121]。同时雄激素还通过增加 FSH 受体表达、FSH 诱导的颗粒细胞芳香酶活性和增殖以及卵泡生长来增强卵泡中的 FSH作用[122]。
TC 作为卵泡的重要组成部分，在类固醇生成、卵泡发育和闭锁中发挥着重要作用。在本研究中，我们选择了卵泡中的细胞体外培养 TC 和 GC 细胞，并研究了其对繁殖相关类固醇激素合成的影响。然而，它不能完全代表整个卵泡的体内微环境。此外，尚不清楚 TC 衍生因子可能对颗粒细胞和卵母细胞产生什么影响。因此，TC 在卵巢中发挥的功能和机制以及 TC 与颗粒细胞和卵母细胞之间的相互作用值得在体内进一步探索。
参考文献（略）
