本文是一篇口腔医学论文，本实验通过酶消化法结合组织块法分离培养兔颌骨 PCs，采用 CCK-8 检测及细胞集落结晶紫染色检测兔颌骨 PCs 的增殖能力；经成骨、成脂和成软骨诱导培养后评价颌骨 PCs 的多向分化能力。在此基础上，探讨了不同浓度蛇床子素（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L）对兔颌骨 PCs 形态、细胞增殖能力、迁移能力、成骨分化能力及细胞外基质合成的作用。
第一部分 兔颌骨骨膜细胞体外分离培养及多向分化能力检测
材料与方法
1. 材料
1.1 实验动物
4 月龄新西兰大白兔，雄性，体重 2.2 kg-2.4 kg，购自上海市松江区松联实验动物场（许可证号码：SCXK（沪）2017-0008）。
1.2 主要实验试剂
戊巴比妥钠（Merck，德国）； 碘伏（利尔康医疗科技有限公司，中国）； 75%医用酒精（利尔康医疗科技有限公司，中国）； DMEM 低糖培养液（Hyclone，美国）； 胎牛血清（FBS；Wisent，澳大利亚）； 磷酸盐缓冲液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国）； Ⅱ型胶原酶（Sigma，美国）；青霉素-链霉素溶液（碧云天生物技术研究所，中国）； 地塞米松（Sigma，美国）； 维生素 C（Sigma，美国）； β-甘油磷酸钠（Sigma，美国）； 0.25%胰蛋白酶（含 0.02% EDTA）（Gibco，美国）； 冻存液（新赛美，中国）； CCK-8（同仁化学研究所，日本）； 结晶紫（西陇化工股份有限公司，中国）； BCIP/NBT 碱性磷酸酶酯酶显色试剂盒（碧云天生物技术研究所，中国）； 茜素红（Sigma，美国）； 兔骨髓间质干细胞成软骨诱导分化培养基（Cyagen，中国）； 兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基（Cyagen，中国）。
结果
1 兔颌骨 PCs 原代培养及形态观察
倒置显微镜观察发现颌骨骨膜经酶消化法后再采用组织块法培养，3 d 即可观察到细胞沿组织块边缘爬出，细胞呈梭形（图 1.1 A），7 d 时组织块边缘爬出的PCs 明显增多（图 1.1 B），10 d 左右可达到 90%融合（图 1.1 C），经 0.25% 胰酶和 0.02% EDTA 消化传代细胞生长状态良好（图 1.1 D）。
讨论
骨膜被认为是间充质祖细胞的储存库，这些细胞在损伤时可被激活并分化形成软骨和骨，从而实现受损伤骨组织的修复[25]。骨膜包含成纤维细胞、成骨细胞、间充质干细胞和周细胞[26]。研究发现骨膜来源细胞在骨愈合和再生方面与骨髓基质细胞的能力相近，甚至更优[27][28]。尽管这两类细胞来源于一个共同的胚胎间充质谱系，但与骨髓基质细胞相比，出生后的人 PCs 在移植后表现出较高的增殖率，更强的克隆形成能力、分化能力和骨再生潜能[29]。研究证实骨膜来源的细胞在单细胞水平上可表现出多向分化潜能[30]，同时保留了其在体外分化的能力[31]。PCs 因其所具备的快速增殖能力和分化为多种间充质谱系的能力有望成为组织工程的重要细胞来源[32]。颌骨 PCs 相较于其他部位的 PCs 获得更为方便，创伤较小可成为牙周组织工程种子细胞的来源。
常用的分离 PCs 的方法包括组织块法[33][34]、酶消化法[35]以及酶消化法联合组织块法[36]。组织块法在原代细胞培养方面需要的周期较长，为了弥补这一缺点，本实验将酶消化法与组织块培养法相结合，采用该方法在缩短细胞获取周期的同时，可使细胞从其自然环境分离出来。实验结果发现将两者方法结合一般 3 天即可获得原代 PCs，细胞形态多为成纤维样，经传代后细胞仍保留较好的生长状态，CCK-8 法对细胞增殖能力的检测以及结晶紫细胞集落染色结果证明所培养的细胞具有较好的增殖能力。
第二部分 蛇床子素对兔颌骨骨膜细胞的影响…………………………19
引言………………………………19
材料和方法…………………………………19
结果………………………………27
讨论………………………………34
小结………………………………35
全文总结…………………………36
第二部分 蛇床子素对兔颌骨骨膜细胞的影响
材料与方法
1. 材料
1.1 实验动物 同第一部分。
1.2 主要实验试剂
戊巴比妥钠（Merck，德国）； 碘伏（利尔康医疗科技有限公司，中国）； 75%医用酒精（利尔康医疗科技有限公司，中国）； 蛇床子素（麦克林，中国）；DMEM 低糖培养液（Hyclone，美国）； 胎牛血清（FBS；Wisent，澳大利亚）； 磷酸盐缓冲液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国）； Ⅱ型胶原酶（Sigma，美国）； 青霉素-链霉素溶液（碧云天生物技术研究所，中国）； 地塞米松（Sigma，美国）； 维生素 C（Sigma，美国）； β-甘油磷酸钠（Sigma，美国）； 0.25%胰蛋白酶（含 0.02% EDTA）（Gibco，美国）； CCK-8（同仁化学研究所，日本）； BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，中国）； BCIP/NBT 碱性磷酸酶酯酶显色试剂盒（碧云天生物技术研究所，中国）； 碱性磷酸酶活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）； 茜素红（Sigma，美国）；
2 方法
2.1 兔颌骨 PCs 的分离培养
同第一部分。
2.2 OST 的配制
将白色针状结晶粉末状 OST 溶于 DMSO 中，配成 10-2 mol/L、10-3 mol/L、10-4 mol/L、10-5 mol/L 的 OST 原液，以无 OST 的 DMSO 作为对照。使用时再用完全培养液稀释 1000 倍，即各组 OST 浓度为 0 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L。
2.3 OST 对兔颌骨 PCs 增殖能力的影响
取生长状态良好的第 3 代兔颌骨 PCs 以 3×103个/孔分别接种于 96 孔培养板，每组各 6 孔，待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L）OST 的完全培养液，每 2 d 换液，采用 CCK-8 检测细胞在1 d、3 d 和 5 d 的增殖能力。根据 CCK-8 试剂盒操作说明，每孔加入 10%的 CCK-8 溶液，37℃孵育 2 h 后酶标仪检测各孔在 450 nm 处的光密度值。
2.4 OST 作用下兔颌骨 PCs 形态观察
取生长状态良好的第 3 代兔颌骨 PCs 以 105/孔的细胞密度接种于 6 孔板内，待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L）OST 的完全培养液，每 3 d 换液，显微镜下观察拍照。
2.5 OST 作用下兔颌骨 PCs 迁移能力影响
取生长状态良好的第 3 代兔颌骨 PCs 以 2×105个/孔分别接种于 6 孔培养板，每组各 3 孔，待细胞融合后更换为无血清培养液 24 h 待细胞周期同步化。用 200 μL 的枪头尖端在培养板的底部进行划痕，并用 PBS 洗涤 2 遍冲洗掉划下的细胞，然后更换为含不同浓度（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L）OST 的低血清培养液（含 1%FBS）对细胞进行培养。在 0 h、24 h 选取每孔的同一位置进行拍照。用 ImageJ 软件计算划痕面积分析细胞的迁移能力，并计算迁移率=（0 h 面积-24 h 面积）/0 h 面积。
全文总结
本实验通过酶消化法结合组织块法分离培养兔颌骨 PCs，采用 CCK-8 检测及细胞集落结晶紫染色检测兔颌骨 PCs 的增殖能力；经成骨、成脂和成软骨诱导培养后评价颌骨 PCs 的多向分化能力。在此基础上，探讨了不同浓度蛇床子素（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L）对兔颌骨 PCs 形态、细胞增殖能力、迁移能力、成骨分化能力及细胞外基质合成的作用。研究结果如下：
1.采用酶消化法结合组织块法可成功分离培养兔颌骨 PCs，所培养的细胞在体外具有较好的增殖能力。
2.兔颌骨 PCs 在成骨诱导 7 d 及 21 d 后行 ALP 及茜素红染色、成软骨诱导 21 d 后进行组织切片行阿尔新蓝染色、成脂诱导 15 d 后行油红 O 染色的结果均为阳
