本文是一篇口腔医学论文，笔者经过研究，得出以下结论：1. Mg-3Mn 合金颌面骨修复材料具有比纯 Mg 更优异的耐生物腐蚀性能。2. Mg-3Mn 合金颌面骨修复材料有利于 BMSCs 和 MC3T3-E1 粘附、增殖。3. Mg-3Mn 合金颌面骨修复材料促进 ALP、Col-Ⅰ、OCN、及 Runx2 的 mRNA的表达，显著诱导 BMSCs 和 MC3T3-E1 细胞成骨分化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
3-4 周龄的雌性 SD 大鼠（80-100g），4 只，购自长沙市天勤生物技术有限公司。许可证号：SCXK (湘)2019-0014。
1.1.2 实验材料
本实验采用课题组前期运用热挤压工艺研发制备的 Mg-3Mn 合金[29]，合金化学成分如表 1 所示；热挤压纯 Mg(99.98wt% Mg)为对照，两种试样采用电火花切割机制成规格为长×宽×厚为 5 ㎜×5 ㎜×2 ㎜的方块。用 500、1000、1500 和 2000 目的 SiC 砂纸在去离子水中打磨试样各个面至光滑，除去其表面氧化层，然后置于无水乙醇中超声荡洗 30min 以去除合金表面的油脂，通风处自然晾干后超净台内紫外线照射 2h 以上。
表 1 Mg-3Mn 合金的化学成分（wt%）
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1.2 实验仪器与试剂
1.2.1 实验仪器
本实验所用到的主要化学药品及其详细信息，如表 2。
表 2 主要实验仪器
（1） BMSCs 原代分离培养
1) 断颈处死雌性 SD 大鼠 4 只，置于体积分数为 75%的酒精内浸泡 5 min后取出；
2) 眼科剪剪开腿部皮肤，暴露关节肌肉，于关节处剪下双下肢（含筋膜及肌肉），置于含体积分数 10%双抗的 PBS 溶液中；
3) 转移至无菌超净台内操作：完全除去骨表面的软组织（肌肉，筋膜）， 暴露胫骨、股骨，无菌纱布擦拭骨表面，含体积分数 10%双抗的 PBS 浸泡清洗 2-3 次，无菌大剪刀剪开两端骨骺暴露骨髓腔，放置于 SD 大鼠 BMSCs 专用完全培养基的无菌培养皿中，1ml 注射器吸取完全培养基充分冲洗骨髓腔 2-3 次至骨髓腔发白，收集骨髓悬液于 15 ml 离心管；
4) 室温离心 5 min (800 rpm/min)，弃上清液；
5) 4ml 完全培养基重悬后转移至 25 cm2 培养瓶中，轻轻摇匀，置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2 饱和湿度培养箱中培养；
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2 结果
2.1 BMSCs 原代培养
细胞悬液接种于培养瓶后，镜下全为圆形的红细胞及造血细胞（图 1A）， 72 h 后首次换液，镜下可见旋涡状排列梭形生长的贴壁细胞，呈现成纤维细胞外观，少数细胞为多角形（图 1B）。随着换液次数增加，杂细胞逐渐变少，继续培养至融合度达 80%-90%进行传代，第二、三代细胞呈长梭形集落样分布，可用于进行后续试验（图 1C，D）。
图 1 BMSCs 形态观察
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2.2 BMSCs 的鉴定
经流式细胞术鉴定，分离培养的第三代 BMSCs 高表达非造血细胞表面标志物 CD44 和 CD90，而低表达造血干细胞表面标志 CD11b 和 CD45，与所报道的BMSCs 表型相符[33]，证实所培养的细胞为 BMSCs。
图 2 流式细胞术检测细胞表型结果
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3 讨论.......................20
4 结论........................30
3 讨论
本课题组前期利用热挤压法制备了不同 Mn 含量（1%wt，2%wt，3%wt）的Mg-Mn 系合金[29]，其中，低 Mn 含量的 Mg-1Mn 合金（含 1%wt Mn）具有较好的耐腐蚀性，细胞活性和成骨诱导性[32]，而高 Mn 含量的 Mg-3Mn 合金（含 3%wt Mn）经万能力学试验机测试，显示其压缩屈服强度（~193MPa）与天然骨的屈服强度接近（130-180MPa），这一点有利于作为骨修复材料应用到机体承力部位缺损当中，因此其生物相容性值得探讨。
细胞毒性检测是评价生物材料的生物相容性最常用的方法之一，包括评价细胞形态、细胞黏附、细胞增殖能力和细胞凋亡等[34]，可分为直接接触实验（即在直接在试样表面培养细胞）和间接接触实验（使用试样的浸提液来培养细胞）。为了确定有毒物质是否会从医疗器械中析出，通常使用间接提取物测定法来评估细胞的生存能力[34]。因此本研究采用直接接触实验评估 Mg-3Mn 合金对于两种细胞的黏附行为和形态学影响，采用间接接触实验来评估 Mg-3Mn 合金对两种细胞的活性影响。
结合本实验的 SEM 结果，可以观察到纯 Mg 在完全培养基中浸泡 7 天后其表面生成了疏松多孔的膜状结构（图 4A），即 Mg(OH)2 沉淀，它将材料基体与腐蚀介质分离开来。但 Mg(OH)2 稳定性较差，与培养基中的 Cl−进一步反应而加速降解（等式（4）（5）），从而形成局部的腐蚀凹坑。Mg-3Mn 合金表面点蚀和电偶腐蚀并存，点蚀是一种典型的局部腐蚀模式，点蚀首先发生在表面膜上形成坑洞，然后由于点蚀前沿的不断塌陷，腐蚀坑横向发展引发裂纹（图 4B）[36]。电偶腐蚀则是在两种具有不同电化学电位的金属在电解质存在下相互接触时发生的，Mg-3Mn 合金中异质分布的 Mn 相作为阴极，与 Mg 基体形成电偶，从而加速了 Mg 的腐蚀速率。结果，邻近 Mn 相的敏感 Mg 基质被优先腐蚀并形成了一些深腐蚀坑和龟裂（图 4B）[37]。SEM 的表面形貌观察结果和 ICP-OES 结果相一致，纯 Mg 表面腐蚀情况比 Mg-3Mn 合金严重，因此纯 Mg 在 DMEM 培养基中浸泡 24h 后浸提液中的 Mg 离子析出浓度远远大于 Mg-3Mn 合金。
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4 结论
1. Mg-3Mn 合金颌面骨修复材料具有比纯 Mg 更优异的耐生物腐蚀性能。
2. Mg-3Mn 合金颌面骨修复材料有利于 BMSCs 和 MC3T3-E1 粘附、增殖。
3. Mg-3Mn 合金颌面骨修复材料促进 ALP、Col-Ⅰ、OCN、及 Runx2 的 mRNA的表达，显著诱导 BMSCs 和 MC3T3-E1 细胞成骨分化。
参考文献（略）
