牙乳头细胞矿化的相关蛋白表达

牙乳头细胞矿化的相关蛋白表达

【摘要】　目的　在人牙乳头细胞中探讨核心结合因子α1(core binding factorα1,cbfa1)能否调控矿化相关蛋白的表达。口腔医学论文范文方法　体外培养人牙乳头细胞,转染pcDNA3-cbfa1重组质粒,稳定表达cbfa1后检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OC)含量,同时采用免疫组化、免疫印迹和PCR等方法观察骨桥素(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨连素(osteonectin,ON)、牙本质基质蛋白(dentin matrix protein 1,DMP1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达。结果　建立了稳定表达cbfa1基因和蛋白的人牙乳头细胞模型PC-3,发现转染后细胞的ALP和OC含量明显增高,OPN、BSP、ON、DMP1的表达也明显增高,但未发现牙本质特异性蛋白DSP及其编码基因DSPP的表达。结论　在人牙乳头细胞中,cbfa1能上调ALP和OC含量,诱导多种矿化组织特异性蛋白的表达,在牙齿发育矿化中有重要作用,提示它与牙乳头细胞分化为成牙本质细胞的启动有关。

【关键词】　牙乳头 细胞培养 　转染 核心结合因子1

核心结合因子α1(core binding factorα1,cbfa1)是成骨分化特异性转录因子,能在前成骨细胞、软骨细胞中上调多种矿化相关蛋白基因的转录[1]。牙乳头细胞是研究成牙本质细胞分化的重要模型,由于cbfa1在体内牙胚发育过程中有时空表达特性[2],那么cbfa1在牙乳头细胞中能否对矿化相关蛋白有调控作用?为此,我们采用基因转染、免疫印迹等方法观察稳定表达cbfa1基因的牙乳头细胞中矿化相关蛋白的表达,以期为阐明成牙本质细胞分化的分子机制奠定基础。

材料与方法1.基因转染:取第6代人牙乳头细胞,接种24孔板,每孔2×105个细胞。待长到90%~95%时, 按LipofectAMINE 2000转染试剂盒(Gibco公司)说明书进行pcDNA3-cbfa1的转染[3,4],设空载体阴性对照和未转染的空白对照。200 mg/L的G418(Gibco公司)加压筛选直至出现抗性细胞克隆,滤纸片法转移至24孔培养板,常规扩大培养,相差显微镜下观察细胞生长状况,同时制备细胞爬片,提取细胞总RNA和总蛋白。2.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OC)含量测定:在96孔板上以4×103个/孔的密度接种细胞,常规培养4 d,取各孔培养液常规测定ALP和OC活性,每组设4个平行孔。3.细胞总RNA提取、反转录和PCR反应:采用Gibco公司的RNA提取和反转录试剂盒进行。PCR引物序列和反应条件分别为: cbfa15′　CGGATATCATGCTTCATTCGCCTCACAAACAAC ,5′CGTCTAGATCAATATGGCCGCCAAACAGACTCA (预期产物1·7 kb);DSPP 5′ggtgtcctggtgcatgaaggt 3′;5′cctcgtcttcatcctcatctg 3′,预期产物片段为600 bp;DMP1 5′gctagctggtggcttctcca 3′;5′cagcaattggctgccacctg 3′,预期产物片段为520 bp。PCR反应条件:94℃5 min,(94℃30 s、56℃45 s、72℃90 s)×10,(94℃30 s、68℃2min)×25,72℃10 min。4.细胞爬片的免疫组化染色:所用抗体为小鼠抗人牙本质基质蛋白(dentin matrix protein 1,DMP1)单克隆抗体由高杰硕士惠赠[5],兔抗人牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)多克隆抗体由张莹博士惠赠[6],兔抗人骨桥素(osteopontin,OPN)多克隆抗体、大鼠抗人骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)多克隆抗体以及小鼠抗人骨连素(osteonectin,ON)单克隆抗体由陆群博士惠赠,免疫组化试剂盒为北京中山公司产品。5.细胞总蛋白的提取和免疫印迹:采用三去污剂裂解缓冲液( Tris-HCl 50 mmol/L, NaCl150 mmol/L, NaN30·02%, SDS 0·1%, NP-401%, PMSF 100 mg/L)裂解细胞,常规提取细胞总蛋白,取上清液,SDS-PAGE电泳2 h,转膜,分别加入小鼠抗人DMP1单克隆抗体和兔抗人DSP多克隆抗体,常规进行Western blot染色,DAB显色。结果1.cbfa1稳定转染人牙乳头细胞模型的建立和鉴定:转染开始几乎无细胞死亡,说明质粒的纯度较高、无污染;加G418 3 d后细胞开始死亡,12 d后未转染组在G418作用下全部死亡,转染组经过4轮G418筛选获得3个抗性细胞克隆,命名为PC-1~3。以抗性克隆扩大培养开始为第T1代,传代到培养皿为第T2代,依次类推。分别以T3、T5、T7代细胞为模板,进行PCR反应。结果表明PC-3抗性克隆cbfa1表达较稳定,而PC-1、PC-2则随着传代表达逐渐减弱。

2.ALP和OC检测结果:稳定转染cbfa1基因后的细胞ALP和OC活性均增高,与转染前相比差异有显著性。3.PCR结果:正常人牙乳头细胞在500 ~600 bp之间未见条带,稳定转染cbfa1基因的细胞牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)仍未见特异性条带,而DMP1则出现特异性条带,大小约为520 bp(图1)。图1　转染前后细胞中DSPP和DMP1基因的表达　　

4.Western blot结果:转染后细胞中出现DMP1蛋白的表达,约95 000处可见阳性反应条带(图2),而DSP的Western blot结果为阴性。图2　转染前后细胞中DMP1和DSP的Western blot结果　　5.免疫组化结果:转染cbfa1基因后的细胞OPN、BSP和ON的表达量明显增加,呈阳性(图3~5),而正常人牙乳头细胞为阴性。讨论cbfa1是一种含runt结构域的能调节器官形成的转录因子,在维持成骨活性、调控成骨细胞分化成熟中起着关键性的作用[1]。cbfa1基因敲除的小鼠无成熟骨的形成,成骨相关基因(ALP、OC、OPN、BSP等)的表达受阻[7]。1997年Mundlos发现人锁骨颅骨发育异常综合征(cleidocranial dysplasia,CCD)患者家族中有cbfa1基因的突变,而且许多CCD家族中均有不同程度的牙齿发育异常现象,有的甚至单独出现牙齿发育异常的表型[8]。原位杂交和免疫组化结果显示,cbfa1在牙胚发育中的表达具有时空特异性,在成牙本质细胞分化成熟以后,cbfa1的表达由外胚间充质“转移”到外胚层来源的成釉细胞中,调控成釉蛋白等的表达[2,4]。这些结果均提示cbfa1参与了牙胚发育,可能与成牙本质细胞、成釉细胞的分化有关。牙乳头细胞来源于神经嵴细胞迁移的间充质细胞,具有分化为成牙本质细胞和牙髓细胞的潜能,体外培养的人牙乳头细胞中不仅cbfa1表达阴性,而且许多矿化相关的细胞外基质蛋白的表达量很低[4]。本项研究采用脂质体转染技术和G418筛选建立了稳定表达cbfa1基因的人牙乳头细胞模型,通过PCR鉴定其中的抗性细胞克隆PC-3能稳定表达cbfa1 mRNA。本研究发现,cbfa1不仅可以上调ALP和OC的活性,还能诱导OPN、BSP、ON和DMP1等矿化相关蛋白的表达,但对牙本质特异性蛋白DSP的表达及其编码基因DSPP无明显作用。cbfa1可使Ⅰ型胶原的表达量增加,但图像分析和统计学结果表明差异无显著性。可见牙乳头细胞也是cbfa1作用的靶细胞,cbfa1可以促进牙乳头细胞表达矿化相关的基因和蛋白,由于ALP、ON、BSP等均表达于矿化的早期,因此提示cbfa1在牙乳头细胞分化为成牙本质细胞的启动过程中起着关键作用。DMP1是1993年George等[9]在筛选大鼠成牙本质细胞和牙髓cDNA文库时发现的一种酸性磷酸化蛋白,曾被认为是成牙本质细胞特异性蛋白。

本研究采用敏感的RT-PCR和Western blot在基因和蛋白水平证实cbfa1在人牙乳头细胞中能够诱导DMP1 mRNA和蛋白的表达。2001年George研究小组报道了稳定转染大鼠DMP1基因的胚胎性未分化间充质细胞系C3H10T1/2和小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1,在形态和功能等方面“分化”成了成牙本质细胞样细胞,表现在细胞器的极性分布、高柱状的细胞形态、牙本质特异性蛋白DPP和DSP的表达以及矿化结节的形成,提示DMP1是成牙本质细胞分化过程中的重要调控分子[10]。有趣的是George发现在上述细胞中过表达DMP1能诱导cbfa1的表达,随后才出现DPP和DSP的表达,而本组在人牙乳头细胞中过表达cbfa1能诱导DMP1的表达,却不能诱导DSP的表达和DSPP基因的转录,提示DMP1与cbfa1之间可能存在着一种正反馈调控机制,使得信号不断放大,最终一系列矿化相关基因被激活,而cbfa1对DPP和DSP的作用可能还依赖于其他转录因子的作用。有报道cbfa1可以与AP-1、Msx-2等转录因子相互作用调控OC的表达[11,12],而DSPP基因启动子上存在AP-1、Msx-1、Msx-2等转