讨论正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因分组
【摘要】 目的研究以白色念珠菌为代表的念珠菌,帮写医学论文以及白色念珠菌基因分组在不同年龄段儿童口腔中的分布情况。方法 4组不同年龄儿童和1组成人作为研究对象,粘膜拭子法取样,CHROMagar Candida鉴定培养基分离鉴定,PCR方法一组引物确认白色念珠菌,一组引物基因分组。结果 不同年龄组儿童口腔中念珠菌的检出率有所不同,除健康青年外,白色念珠菌在检出的念珠菌中均占多数。白色念珠菌3种基因分组的分布也存在差异,以A组为主。结论 不同年龄阶段健康儿童口腔中,A组白色念珠菌组占主导地位。
【关键词】 白色念珠菌;基因分组;口腔;儿童
白色念珠菌(又称白色假丝酵母菌)是口腔正常微生物群的组分之一,也是口腔中重要的条件致病微生物,是包括新生儿“雪口症”在内的许多口腔疾病的致病菌〔1〕。目前关于不同疾病状态下口腔中白色念珠菌的研究比较多,但是对正常状态下口腔中白色念珠菌的分布,了解还比较少。以前的研究表明,白色念珠菌在不同年龄阶段人群的口腔中,可不同程度的检出〔2〕。白色念珠菌与口腔中的其它微生物共同作用,相互粘附,维持口腔中的正常生态平衡。研究表明,白色念珠菌与格登链球菌(Streptococ-cus gordonii)有复杂的相互作用。另外,白色念珠菌与正常的口腔粘膜之间也有复杂的粘附机制,唾液中的富脯蛋白有介导白色念珠菌粘附的作用〔3〕。研究不同年龄阶段人群口腔中白色念珠菌的分布情况,以及对其进行进一步的基因分组,研究不同基因分组白色念珠菌的分布特征,是白色念珠菌分子流行病学研究的重要内容。我们研究了从新生儿到青少年的4个人群,了解了不同年龄阶段儿童口腔中以白色念珠菌为代表的念珠菌群的检出情况,以及白色念珠菌的基因分组情况,为研究白色念珠菌早期定植以及正常演替提供基础。
材料和方法
研究对象:共有5个研究人群,A1(新生儿组):出生1周以内的健康新生儿打分在9分以上者,共有40名,男孩18名,女孩22名,平均年龄为3 d。A2(乳牙列儿童组):40名,平均年龄为3.2岁,男孩21名,女孩19名。A3(混合牙列期儿童组):55名,平均年龄7.2岁,男孩32名,女孩23名。A4(恒牙列儿童组):57名,平均年龄12.7岁,男孩34名,女孩23名,乳牙已经全部换完。A5(健康青年组):40名,平均年龄20.4岁,男性16名,女性24名。纳入标准为无系统性疾病和遗传疾病,没有龋病、明显牙周疾病以及口腔粘膜病。以上人群均来自成都本地或在本地生活1年以上(新生儿除外)。
主要实验器材和试剂:鉴定培养基CHROMagarCandida(法国科玛嘉公司);PCR使用试剂,包括Taq聚合酶以及引物的合成(TaKaRa大连宝生物工程公司);小量酵母菌DNA提取纯化试剂盒(上海华舜生物工程公司);梯度PCR仪GradientThermal Cycle(Ep-pendorf公司,德国);Bio-RAD凝胶成像及分析系统(gel-Doc 2000美国)。
取样及分离鉴定取样方法:使用改良的棉拭子法,在每一名儿童的口腔颊粘膜处反复涂擦5次,将棉拭子头部剪断,放入事先消毒灭菌的装有500μl PBS液的离心管中,在2 h以内送到实验室,将其在VERTEX上振荡2min,无菌镊子将拭子头部的液体尽量挤出,将所有的样本调整到300μl,弃去多余液体,6 000g离心10min,弃去上清液,用100μl的PBS液重新混悬,准备接种。
接种培养和鉴定:取样本15μl接种在CHROMa-gar Candida鉴定培养基,37℃恒温细菌培养箱需氧培养48 h,根据培养基上菌落的颜色来判断不同的念珠菌种类,绿色菌落是白色念珠菌,紫色菌落是平滑念珠菌,蓝色菌落是热带念珠菌,白色为不能鉴定出来的其它念珠菌〔4〕。为确认白色念珠菌,用PCR的方法作进一步的鉴定。
白色念珠菌DNA的提取、鉴定和基因分组:按照小量酵母菌DNA提取纯化试剂盒使用说明要求,将已纯化的单个菌落从培养基中挑出,麦氏比浊法,用灭菌的PBS缓冲液将细菌数目调整到109/ml,使用lyticase酶破细胞壁,蛋白酶K消化蛋白,RNase除去RNA,吸附柱法获得白色念珠菌的DNA。白色念珠菌的鉴定,根据文献〔5〕的方法,使用针对白色念珠菌线粒体DNA上的EO3序列而设计的一对引物,引物1:5′-CACCAACTCGACCAGTAGGC-3′;引物2:5′-CGGGTGGTCTATATTGAGAT-3′。反应条件94℃预变性5min,然后94℃1min,56℃2min 30s,72℃3min,30个循环以后72℃延伸7min。反应产物用2%的琼脂糖电泳,100V 40 min,溴乙锭显色,白色念珠菌的扩增产物是125bp左右。白色念珠菌基因分组,根据Micheal J〔6〕的方法,针对白色念珠菌25S rDNA的一段内含子序列设计一对引物,CA-INT-L:ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-CA-IN-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3。反应条件是94℃3 min预变性,然后94℃1 min,67℃1min,72℃2min 30 s,30个循环。反应产物用1.5%的琼脂糖电泳,100V 30 min,根据扩增产物的大小确定不同的基因分组,480bp为A组,840bp为B组,以上2条产物都有者为C组,产物为1 080bp的为D组,产物为1 400bp的为E组。
培养鉴定以及白色念珠菌的基因分型,阳性对照均采用白色念珠菌的参考菌株ATCC90038(由四川大学华西口腔医学院粘膜病研究室陈谦明教授惠赠)。
统计学方法:采用Fisher精确检验。
结果
1·经过鉴定培养基的培养鉴定,共检出白色念珠菌为主的3种念珠菌,分别是白色念珠菌、平滑念珠菌、热带念珠菌和一些尚未鉴定的念珠菌菌种,各组白色念珠菌的检出率分别是:A1组7.50%,A2组57.50%, A3组47. 27%, A4组40. 35%, A5组27.50%(表1);白色念珠菌在检出念珠菌中所占的比例分别为A1 100%,A2 79.31%,A3
78.79%,A474.19%,A5 35.48%。白色念珠菌和平滑念珠菌共存的现象比较多见,A2组有1例,A3组有2例,A4组有2例,B组有5例;白色念珠菌和热带念珠菌共存也可以见到,A4组有1例,B组有2例
2·鉴定培养基上呈绿色的菌落,经过PCR鉴定,均为白色念珠菌,PCR电泳结果
3·对白色念珠菌进行基因型鉴定,共检出A、B、C 3组,其中C组在840bp左右出现2条带,而且都比较清楚,没有发现其它2组,A组在各组均占主导地位,各年龄组A组白色念珠菌的比例分别是,A1100%、A2 82. 61%、A3 92. 32%、A4 91. 30%、A581.82%(表2),PCR电泳结果见图2。没有发现同一样本中存在2组以上(含2组)。
讨论
研究病理状态下白色念珠菌的分布,首先应该了解其在正常状态下的情况,而且其作为口腔正常微生物群的组成,在维持口腔生态平衡上,也有其重要的作用〔1〕。目前对正常口腔中念珠菌群分布的研究比较少,研究结果也有比较大的差别。有人发现,新生儿时期口腔中的念珠菌检出率只有5.9%,新生儿1周出院时的检出率是14.2%,在1个月左右的婴儿,检出率可以达到1个高峰(84%)〔7〕,然后检出率出现下降趋势,1岁的时侯大约是50%。英国对学龄儿童口腔中念珠菌的研究,其检出率大约是70%〔8〕。Kleinegger〔2〕的研究提示,0.5~1.5岁儿童的检出率是44%,5~7岁儿童则是24%,15~18岁年龄组的检出率是40%。造成这种差别的原因,包括取样人群的不同,地区差别和取样部位、取样方法和检出方法的差别。在预实验中我们研究了不同的口腔取样部位、不同的培养鉴定方法,对口腔白色念珠菌检出率的影响,研究表明,用标准棉拭子取样并结合离心浓缩,接种在念珠菌的鉴定培养基CHROMagar Candida中,培养鉴定同时完成的方法是简单有效的方法。本研究发现,白色念珠菌的检出率,不同年龄的儿童差异有非常显著性。主要是因为新生儿组很低,与已有的研究结果相似。从乳牙列儿童开始,检出率有下降的趋势,而在健康青年组,检出率只有27.5%,这个检出率与A2(乳牙列儿童)差异有显著性,但是整个念珠菌群的检出率并没有下降,因为随着年龄的增大,其它种类的念珠菌开始增多,所研究的4个年龄段的儿童口腔中,白色念珠菌都占据主导地位,而到了成人组,其它念珠菌明显增多,白色念珠菌的构成比已经下降到35.38%,与4个儿童组差异有显著性。Kleinegger〔2〕在其研究的30~45岁和大于60岁的两组中,白色念珠菌仍占主要地位,这种差别可能是地域不同造成的,或有可能随着年龄的增大,口腔环境又发生了新的变化,比如各种义齿的出现,白色念珠菌的检出率又重新出现了上升,对此尚待进一步研究。
研究证明了CHROMagar Candida鉴定培养基对鉴定白色念珠菌的有效性〔9〕,但是因为对白色念珠菌进行基因分组采用的方法,其它种类的念珠菌比如热带念珠菌的扩增结果与白色念珠菌A组相同〔6〕,必须对鉴定出的白色念珠菌进行进一步确认,因此我们使用了一对引物,用PCR的方法进行确认,结果表明,鉴定培养基和PCR的结果复合率是100%,同时也证明了这种鉴定培养基的准确性。
对白色念珠菌进行基因分组,是从基因水平研究白色念珠菌的重要手段,方法也比较多,但是一般操作比较复杂,在分子流行病学研究中,难以发现有
