摘要 合成了双功能联结剂肼基烟酰胺(HYNIC),经过了1HNMR的确认.用HYNIC与人血清白蛋白(HSA)偶联,经过透析纯化后得到HYNIC-HSA.用SnCl2作为还原剂,EDTA作为共配体所制得的99mTc-HYNIC-HSA的放化纯度高于90%.其小鼠体内生物分布实验表明99mTc-HYNIC-HSA在血液内的摄取和滞留情况明显优于其他方法标记的HSA,与已用于临床的99mTc-DMP-HSA相似,是一种很有潜力的新型心血池显像剂.
心血池显像是通过脏器的血液循环情况来反映其功能的有效诊断方法,除了在诊断心脏功能方面有独特的作用外,还可以有效诊断脑血管、肝血管等疾病及进行脾功能的测定和胃肠出血定位等,在临床上有很广泛的应用.目前临床较常用的99mTc心血池显像剂有99mTc标记的血红细胞(99mTc-RBCs),99mTc标记的人血清白蛋白(99mTc-HSA)等.其中99mTc-RBCs标记稳定,在脉管区域有很长的保留时间,生物性能优良.不过由于标记需要病人的自体红细胞,无法制得RBC药盒,这使得99mTc-RBCs标记复杂、费时,并有一定潜在的危险性,大大限制了其应用.人血清白蛋白(HSA)是血液中的天然成分,有很长的生物半衰期,但是它与99mTc的结合不牢固,99mTc-HSA在血内的放射性清除快,因此显像效果不理想.用双功能连接剂同HSA偶联后再用Tc99m进行标记,便可以同时解决99mTc-RBCs的复杂、费时和破坏二硫键对蛋白的影响等问题. 1993年,Kristin等[1]人首次合成了99mTc-DMP-HSA,通过在HSA上引入含有巯基的双功能联结剂来提高HSA与99mTc的结合能力.实验结果表明99mTc-DMP-HSA的生物性能堪与99mTc-RBCs相媲美,目前国外已将99mTc-DMP-HSA药盒化,并试用于临床[2-3].为满足国内临床的需求,我们引入新型双功能连接剂肼基烟酰胺(HYNIC)并进行了研究.本文详细报道了HYNIC-HSA的制备过程,99mTc-HYNIC-HSA的合成方法和层析鉴定结果及其生物分布性质.
1 实验
1.1 试剂及仪器 HSA(德国Centeon Pharma GmbH); ITLC-SG(美国);新华一号滤纸;w=80%水合肼,分析纯,天津市博迪化工有限公司;六氯尼古丁酸,分析纯,ACROSOrganics,USA;N,N-二甲基甲酰胺(DMF),分析纯,天津市博迪化工有限公司;三乙胺,分析纯,天津市博迪化工有限公司;二叔丁基二碳酸酯(Boc2O),Advanced Chem Tech,USA;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),纯度97%,Aldrich Chemical Company,Inc;N,N-二环己基碳二亚胺(DCC),Advanced Chem Tech,USA;EDTA,分析纯,中国医药公司北京采购供应站经销;碳酸氢钠、磷酸二氢钠,均为化学纯,北京市红星化工厂;乙醚,分析纯,天津市化学试剂三厂;乙酸乙酯、石油醚(60~90℃)、无水乙醇、氯化亚锡,均为分析纯,北京化工厂;对硝基苯甲醛,分析纯,防化学院化工厂.DMS300紫外-可见分光光度计,美国Varian公司;FH-408自动定标器,国有二六一厂;FJ-391型同位素活度计,北京核仪器厂;FT-603井型闪烁探头,北京核仪器厂;ITLC-SG,美国;78-1型磁力搅拌器,杭州仪表电机厂;SHZ-3型循环水真空泵;HITACHI 260-50红外光谱仪,日本;UltraShield 500兆超导核磁.1.2 HYNIC的合成 HYNIC的合成路线如下[4]:把6-氯-尼古丁酸(8.0 g;50.77 mmol)加到w=80%的水合肼(35 mL,930.0 mmol)中,并一起在100℃油浴中加热4 h.之后把均匀的反应混合物冷却到室温,浓缩干燥得到白色固体.把固体溶在水中并用浓盐酸调节酸度到pH5.5,这时出现沉淀物.沉淀物经过滤分离,所得固体用φ=95%乙醇和乙醚洗涤并真空干燥得6.0 g的6-肼基吡啶-3-羧酸(化合物1).产率为77%.θmp为291~293℃.把Boc2O(2.13 g;9.8 mmol)加入到化合物1 (1.4 g;9.8 mmol)和三乙胺(1.2 mL,11.8 mmol)的DMF(10 mL)溶液中. 1 h后反应混合液变得均匀,继续在室温下搅拌16 h.然后,反应混合物在减压下被浓缩干燥得到棕黄色的固体.残余物用最少量的乙酸乙酯溶解,并用乙酸乙酯作为淋洗液过230~400目的硅胶,以除去有色不纯物.把淋洗物浓缩干燥,无需纯化便可进行下一步反应,得6-叔丁氧羰基肼基吡啶-3-甲酸(化合物2 )2.33 g,产率94%.把DCC(1.18 g,5.75 mmol)的DMF(5 mL)溶液加入到化合物2(1.45 g,5.75 mmol)和NHS(0.66 g,5.75 mmol)的DMF(15 mL)中.1 h后反应混合物变得浑浊,在室温下继续搅拌16 h,过滤反应混合物并浓缩干燥得到棕黄色残余物.残余物用最少量的乙酸乙酯溶解,并用乙酸乙酯作为淋洗液过230~400目的硅胶.把淋洗物浓缩干燥得1.2 g琥珀酰亚胺-6-叔丁基氧羰基肼基吡啶-3-甲酸(化合物3),黄色固体,用乙酸乙酯/己烷重结晶化合物3.产率60%;θmp为169.5~172.0℃.把HCl气体以适当的速率通过二氧杂环己烷10 min,得到HCl的二氧杂环己烷溶液.把化合物3(100 mg,0.283 mol)溶在二氧杂环己烷(2 mL)中,再加入HCl/二氧杂环己烷(2 mL),在室温下搅拌反应混合物,5 min后,溶液变得浑浊并有沉淀产生,继续搅拌4 h,过滤浑浊的反应混合物,固体用乙醚重复洗涤,得到55 mg琥珀酰亚胺-6-肼基吡啶-3-甲酸(化合物4)白色固体,产率67%.1.3 蛋白与HYNIC的偶联 取2 mL(200 g•L-1)的HSA稀释到20 mL,质量浓度ρ≈20 g•L-1.往上述蛋白中逐滴加入琥珀酰亚胺肼基烟酰胺盐酸盐(4.31 mg溶于2 mLDMF中),避光搅拌5 h.取出联接后的HSA,用pH=7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液,用处理过的透析膜进行透析,在24 h的透析过程中更换了4次磷酸盐缓冲液.24 h后取出蛋白,用0.2μm的微孔滤膜过滤后分装于真空青霉素小瓶中,避光保存.1.4 HYNIC-HSA分子中HYNIC数目的测定 蛋白质HSA在280 nm处有特征的紫外吸收峰,可以用紫外分光光度计检测收集蛋白,其吸光度A0与质量浓度ρ0关系符合郎伯比尔定律,ρ0=A0/ε(ε=0.58),测定蛋白在280 nm处的A0,可计算出其ρ0.与蛋白偶联的HYNIC的肼基可以通过和对硝基苯甲醛反应生成相应的腙(一对一生成),测定该腙的特征紫外吸收峰(294 nm)处的吸光度A1(ε=2.53×104),HYNIC的质量浓度ρ1=A1/(2.53×104),每分子蛋白中所引入HYNIC数N=ρ1×68 000/ρ0(Mr=68 000).1.5 HYNIC-HSA的99mTc标记1.5.1 共配体EDTA量对标记率YL的影响 25℃下,用pH7.4的磷酸缓冲溶液配制含10 mg HSA,0.1 mg SnCl2,3.7×107Bq99mTcO-4的溶液,加入不同质量的EDTA,各于25℃下反应1 h,分别走新华1号纸(丙酮)和ITLC-SG(ACD).1.5.2 氯化亚锡量对YL的影响 25℃下,用pH7.4的磷酸缓冲溶液配制含10 mg HSA,5 mg EDTA,3.7×107Bq99mTcO-4的溶液,加入不同质量的SnCl2,各于常温下反应1 h,分别走新华1号纸(丙酮)和ITLC-SG(ACD).1.5.3 pH对YL的影响 25℃下,用pH 7.4的磷酸缓冲溶液配制含10 mg HSA,0.1 mgSnCl2,3.7×107Bq99mTcO-4的溶液,调成一系列的pH值,各于常温下反应1 h,分别走新华1号纸(丙酮)和ITLC-SG(ACD).1.5.4 反应时间对YL的影响 25℃下,用pH7.4的磷酸缓冲溶液配制含5 mgEDTA,0.1 mgSnCl2,3.7×107Bq99mTcO-4和10 mg HSA的溶液,于常温下反应不同的时间,分别走新华1号纸(丙酮)和ITLC-SG(ACD).1.6 99mTc-HYNIC-HSA的生物分布 取正常的昆明小鼠(18~22 g),每个时相3只小鼠,尾静脉注射0.1 mL(7.4×105Bq)的99mTc-HYNIC-HSA,分别在注射后10,30,60,90,120 min将其断颈处死,取血及心、肝、肺、骨、肾等脏器,称其质量,并在井型闪烁探测器中测量放射性,计算每个脏器的注射剂量百分数即摄取率XID(XID=A脏器/A总注射量)和单位质量摄取率am(am=XID/m脏器)及血与各脏器的am之比.
2 结果与讨论
2.1 HYNIC的鉴定 1HNMR,δ:2.88(s,4H),7.01(d,J=8.8 Hz,1H). 8.83(d,8.8 Hz,1H).2.2 HYNIC-HSA分子中HYNIC的数目 实验测得每个蛋白分子上引入的HYNIC数目平均值近似为4.2.3 99mTc-HYNIC-HSA的最佳标记条件 选择的最佳标记条件结果见表1.表1 标记条件对标记率YL的影响m(EDTA)/mgYL/%m(SnCl2)/mgYL/% pHYL/%
