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氧化铝生物陶瓷骨细胞相容性研究

日期:2018年01月15日 编辑: 作者:无忧论文网 点击次数:2715
论文价格:免费 论文编号:lw201005101422322460 论文字数:6000 所属栏目:生物医学工程论文
论文地区:中国 论文语种:中文 论文用途:职称论文 Thesis for Title

[摘 要] 目的:观察氧化铝生物陶瓷材料的细胞相容性。方法:选用Wistar乳鼠颅顶骨成骨细胞,采用体外细胞培养方法,将细胞接种于氧化铝生物陶瓷材料表面后,分别观察1、7、14、21、28 d时细胞在材料表面的附着、增殖情况,采用SEM观察细胞在材料表面的形态变化,并且对28 d内细胞的碱性磷酸酶活性进行检测。结果:成骨细胞在材料表面的细胞增殖数与对照组间差异无显著性,细胞在材料表面伸展良好,粘附牢固,并具有良好的细胞形态及增殖率,碱性磷酸酶活性逐渐增加。结论:氧化铝生物陶瓷材料具有良好的细胞相容性。   人体硬组织替代材料用于修复各种原因所致的骨缺损、畸形等,恢复或重建其生理功能,目前常用的有金属、陶瓷、高分子三大类,生物陶瓷材料根据其性质和在机体组织学反应类型,又分为生物惰性陶瓷、生物反应性陶瓷和生物可吸收性陶瓷三大类,氧化铝是具有代表性的生物惰性陶瓷。但是,迄今为止,国内外有关氧化铝生物陶瓷细胞相容性方面的报道很少见。本实验选用体外分离培养的Wistar乳鼠颅顶骨成骨细胞,将其接种于氧化铝生物陶瓷材料的表面,观察细胞在材料表面生长及增殖情况,从细胞学的角度研究材料的骨细胞相容性,为临床使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 氧化铝生物陶瓷的制备 制备直径为10 mm、厚1.0 mm的氧化铝生物陶瓷材料(吉林大学材料科学与工程学院无机非金属材料实验室提供),将圆片用75%乙醇超声振荡清洗后,再用三蒸水超声振荡清洗3遍,烘干,60Co辐射灭菌后备用。
1.2 成骨细胞的培养 无菌条件下取24 h新生Wistar大鼠颅顶骨,用无血清DMEM冲洗,再用0.25%胰酶消化,清除脂肪和软组织,剪成1 mm×1 mm×1 mm~3 mm×3 mm×3 mm的小块,用0. 1%胶原酶消化45 min,置于20%FCS DMEM中,37℃、5% CO2及饱和湿度下培养。3 d后首次换液,后隔日换液,至7~14 d贴壁细胞融合成单层,用2.5 g•L-1胰酶消化后传代4次。
1.3 培养细胞鉴定 ①活体相差显微镜观察:用倒置相差显微镜(Olympus BX-70型)逐日观察细胞的生长情况和形态学特征。②瑞氏-吉姆氏染色:将爬满细胞的玻片取出,生理盐水冲洗,滴入瑞氏-吉姆氏染液,观察细胞形态及细胞核情况。③碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色:将爬满细胞的盖玻片取出,生理盐水冲洗,800 mg•L-1冷丙酮固定,采用钙钴法测定细胞ALP活性。④超薄切片透射电镜观察:将传代4次后的成骨细胞用2.5 g•L-1胰蛋白酶消化脱壁,制成细胞悬液,低速离心收集细胞,用20 mg•L-1戊二醛液固定后,按常规电镜方法制成超薄切片,在JEOL-2000EX透射电子显微镜下观察其超微结构。
1.4 细胞在材料表面附着、增殖 将氧化铝生物陶瓷材料圆片放入24孔板内,加入1 ml的DMEM培养液浸泡24 h后,将细胞接种于材料表面,浓度为5×107•L-1;无涂层圆片的培养板作为对照组。37℃、5% CO2的条件下用矿化液(含10 mmol•L-1β-甘油磷酸钠、50 mg•L-1维生素C的DMEM培养液)培养28 d,细胞分别在接种后第1、7、14和21 d用0.25 g•L-1胰酶0.3 ml消化15 min,再加0.7 ml的DMEM终止消化,充分吹打后,收集消化液。定量后在倒置显微镜下进行细胞计数,每组重复3次,取平均值。
1.5 细胞在材料表面的ALP活性 将上述实验中各时间段的细胞悬液离心、弃上清,加入体积分数为0.003 Triton-X100 100μl,4℃过夜,将其移入96孔板内,再加入100μlALP底物液,37℃孵育40 min ,加入50μl的1 mol•L-1NaOH终止反应,在酶联免疫仪上用410 nm波长测吸光度(A),统计分析。1.6 细胞在材料表面的形态学观察 将培养至第1、7、14、21 d的涂层圆片分别取出,用0. 01 mol•L-1的PBS(pH7.4)洗3遍,用0.3%戊二醛固定,乙腈梯度脱水,临界点干燥,喷金,扫描电镜观察。

2 结 果

2.1 细胞在材料表面的附着与增殖 第1、7、14、21 d成骨细胞在材料表面附着及增殖的数量统计见图1。可以看出成骨细胞在材料表面附着及增殖情况良好,各时间段材料表面的细胞数量与对照组之间差异无显著性(P≥0.05)。Time (t/d)Fig.1  Osteoblast proliferation on alumina ceramics
2.2 细胞在材料表面的ALP活性 通过测量成骨细胞分泌的ALP活性的相对强弱来表示成骨细胞在材料表面的功能。从第7、14、21、28 d测试的ALP的吸光度(A)可以看出,随着培养时间的增加ALP的活性逐渐增强,各时间点与对照组之间差异无显著性(P≥0.05),见图2。
2.3 成骨细胞在材料表面形态学观察 细胞接种在材料表面的第1天伸展良好,多个细胞突起牢固附着在材料表面。培养至第7天细胞突起伸展到材料表面的颗粒间,胞浆伸展并包裹材料表面的颗粒,在细胞表面也有磷酸钙颗粒形成。第14天细胞分泌基质并连接成网状,牢固附着在材料表面及颗粒间。第21天细胞分泌的细胞外基质更加丰富,贯穿于材料的颗粒间,材料表面也有再结晶形成,见图3。Time (t/d)Fig.2  Alkaline phosphatase activity of osteoblasts culturedon alumina ceramicsFig.3  Scanning electron micrographs illustratingosteoblast adhesion on alumina

3 讨 论

氧化铝生物陶瓷除了化学稳定性和生物惰性外,还具有高硬度和优良的耐摩擦及抗磨损等优点。Boutin等发现高纯(99.5%)氧化铝粉末可以在等静压条件下压塑成型,随后将坯体在1600~1800℃条件下烧结,可以使之变为晶粒小于5μm的致密多晶固体。氧化铝的物理和机械性能都是由其纯度、晶粒、晶粒直径分布、孔隙率以及嵌杂物等决定的。现在,先进的陶瓷技术可以使氧化铝的晶粒直径达到1μm量级以及更小的粒度分布,以改善这些目前所知道的可能影响材料强度的因素。目前对生物材料的生物相容性评价方法有二种,一种是动物体内实验法,将材料植入体内,分阶段将植入体与周围组织取出后作组织学检查。另一种为体外细胞培养法,将材料或其浸提液与各种细胞一起培养,以研究材料对细胞生长、附着、增殖及代谢方面的影响。Johnson认为在区别生物材料对细胞影响方面,体外培养法较体内法更为敏感直观。成骨细胞作为骨组织的主要功能细胞,承担着骨的修复和改建功能。因而成骨细胞接种在生物材料,尤其是硬组织替代材料表面的形态及功能变化,可客观反映该替代材料的细胞相容性,较之其它细胞如成纤维细胞更灵敏可靠。体外成骨细胞培养法可从细胞水平、分子水平探讨材料和骨细胞之间的相互作用关系,为综合评价材料的骨细胞相容性提供了有价值的实验模型。本实验研究将成骨细胞接种在氧化铝生物陶瓷材料表面,使植入材料与骨组织的主要功能细胞——成骨细胞相接触,不仅可以考察材料对细胞的影响,而且有助于考察材料与细胞间的相互作用,从更深层次探讨材料-细胞界面结合机制,使其结果与体内实验更加吻合。细胞在材料表面的附着是成骨细胞在材料表面发挥功能的前提。本实验观察到成骨细胞可以在氧化铝生物陶瓷材料表面附着并增殖良好。扫描电镜观察可以看到成骨细胞在该涂层材料表面伸展良好并牢固附着在材料表面,细胞突起伸展到材料表面的颗粒间,并且随着培养时间的延长,细胞分泌大量细胞外基质并连接成网。这说明成骨细胞与氧化铝生物陶瓷材料间具有良好的相容性。同时本实验还对成骨细胞在材料表面的功能进行了研究,ALP是成骨细胞分化的主要特征酶之一,以往常用检测ALP活性来鉴别成骨细胞,观察成骨细胞的功能。本实验结果表明随着细胞的增殖,ALP的活性逐渐增强,说明成骨细胞在该涂层材料表面能发挥良好的功能。通过以上实验研究可以初步认为氧化铝生物陶瓷材料具有良好的细胞相容性。

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