各种原因造成骨缺损的治疗一直是骨科界的难题之一。传统的治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植和生物材料替代等。这些方法均不同程度地存在着来源困难、免疫排斥及成骨能力不确定等缺点。在对较大骨缺损进行骨移植时,新骨形成之前移植骨可能已被机体吸收,造成植骨失败[1]。骨组织工程的提出和发展为这一医学难题开辟了新的解决途径。随着骨组织工程研究的快速发展,组织工程化骨已成为最有希望进入临床应用的组织工程成果之一。
骨组织工程和其他组织工程一样,需要3种基本生理因素:种子细胞,这些细胞可以由前体细胞诱导而来;也可以在相似的微环境中生长产生。促进细胞生长和分化的生物因子,这些生物因子可以由外源供给;也可以是转化细胞产生的纯化蛋白;也可以由骨基质或分泌细胞获得。支架,这种支架是细胞赖以生长的材料,它可以吸附粘附分子、分化因子和生长因子等生物活性物质,可以逐渐被种子细胞产生的基质所替代[2]。其中,细胞与支架材料的相互作用是组织工程研究的主要领域,细胞与材料的粘附是基础,细胞必须与材料发生适当的粘附才能进行迁移、分化和增殖。无论是在体外还是在体内,最先直接与组织细胞接触并发生作用的是材料的表面,因此细胞粘附到材料表面相当重要,且粘附特性的差异也将会影响细胞的增殖、分化等一系列反应[3]。所以,对种子细胞和材料粘附的研究不仅为骨组织工程研究筛选出适于种子细胞发挥生理功能的细胞外支架材料,而且也可以为生产可用于临床的组织工程化活性骨提供主要的方法和手段。现就种子细胞与材料的粘附综述如下。
1 种子细胞与材料粘附的机制
种子细胞与材料表面粘附的位点称为粘附斑(Adhesionplaques),这种局部接触是一种紧密连接,细胞膜与材料表面的距离在10~15 nm之间。在体内这种连接除了血管内的内皮细胞外几乎没有,因为血管内皮细胞要承受较大的血流动力压。种子细胞在材料表面的粘附是细胞膜上的受体与吸附于材料上的粘附蛋白发生作用的结果。成骨细胞主要功能是合成、分泌骨基质并促进基质钙化形成骨组织,细胞内碱性磷酸酶(ALP)含量较高,分泌Ⅰ型胶原、骨结合素、骨钙素、骨桥蛋白、纤维连接蛋白及一系列生长因子[4]。这些因子已被证明具有促细胞粘附的作用,这些蛋白中均含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)。这一序列被称做粘附序列,当它被细胞膜表面的整和素受体特异识别后激活细胞内的细胞骨架蛋白、蛋白酶、蛋白激酶、磷酸酶和信号传导系统,促使细胞发生一系列的生理生化反应,铺展而粘附于材料上[5]。
2 种子细胞与材料粘附的影响因素
细胞与材料的粘附是一个包括多因素的复杂过程,受多种因素的影响。由于种子细胞真正接触的是材料的表面,因此材料的表面性质对种子细胞与材料的粘附有着主要的影响,其影响因素主要有生物学因素和材料因素两个方面。
2•1 生物学因素
生物学因素是指同细胞膜的组成及其性能有关的因素,包括细胞膜的荷电性质、细胞的代谢状态、细胞的亲疏水性、细胞的表面电荷、细胞膜分子的运动方向、细胞膜的柔韧性、细胞表面大分子结构改变而产生的近距位阻力、细胞与材料接触的时间等[6]。
2•2 材料因素
材料因素主要指材料表面的荷电特性、表面自由能、表面的亲疏水性、材料的化学结构以及材料的形态结构等。一般规律为亲水性的表面有利于种子细胞的粘附生长,高表面能的材料表面有利于细胞的粘附与铺展。材料表面的电荷性质与电荷密度对细胞生长有重要的影响,在无血清时,细胞在带正电荷的材料表面上的粘附增加。主要是因为带正电荷的材料表面与带负电荷的细胞之间的静电作用有利于细胞的粘附。生物材料必须既能支持细胞的粘附,又能使粘附细胞在材料上很好地铺展与生长并维持种子细胞的表型[7]。材料本身及其降解产物必须对细胞无毒性,合适的材料表面能有选择性的吸附环境中的粘附蛋白,克服对环境中蛋白质吸附的无选择性,有利于增强对细胞的粘附性。材料的表面结构也影响种子细胞的粘附,粗糙的表面结构有利于细胞的粘附,且有利于生物膜的迅速再生长[8]。组织工程细胞支架须有一定的三维结构,且其多孔结构及孔径的大小都影响细胞的粘附、迁移及营养物质、信号传导物质及细胞代谢废物的交换[9]。骨组织工程的细胞支架材料也不例外。
3 种子细胞与材料粘附的研究现状
研究证明:种子细胞是通过细胞外基质介导而粘附于支架材料的。目前感兴趣的研究方向有:不同化学成分的支架材料对细胞粘附特性产生的影响;支架材料不同表面形态、粗糙度对种子细胞粘附行为产生的影响以及一些蛋白质和多肽因子对种子细胞粘附特性的影响。
3•1 骨组织工程应用的支架材料
支架材料无论是天然材料还是人工合成材料都必须有良好的细胞界面,良好的表面活性,有利于细胞的粘附,并为细胞在其表面生长、增殖、分泌基质提供良好的微环境。自从20世纪60年代Van de Putte等[10]把脱钙骨作为支架在实验动物身上异位成骨后。Kirker-Head等[11]应用BMP-2和PLA/PGA复合治疗羊股骨干骨缺损。经过近10年的发展,目前在骨组织工程中用作细胞支架的生物材料有天然高分子(如:甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白等)、天然无机物(如:羟磷灰石、珊瑚礁等)、合成高分子(如:脂肪族聚酯、聚原酸酯、聚醚)及合金(如:钛、铝合金)等。这些支架材料都不同程度地存在着细胞亲和力低下的缺陷。
3•2 支架材料细胞亲和性的改建
随着细胞生物学、分子生物学及材料科学等相关学科的发展,细胞和细胞外基质材料之间的相互作用日益受到重视。一般情况下,细胞在中等湿润的材料表面粘附性最强,Mikos等[12]通过乙醇和水两步预湿方法,对细胞支架进行预湿,增加亲水性,使其对种子细胞的粘附性增加。骨组织工程中的细胞支架必须具有三维结构及相互连接的适宜大小的空洞,才有利于种子细胞的粘附、迁移和钙化,从而形成新骨。Mikos等[13]成功地应用层压技术合成了具有精细解剖形态的三维立体生物降解性聚合物泡沫,制成的特定形状、空隙率达90%的支架提高了细胞的粘附和增殖能力。Lee等[14]把天然可降解多聚物脱乙酰壳聚糖(Chitosan)和磷酸三钙(TCP)混合制成多空性三维泡沫状支架,提高种子细胞的粘附、增殖和钙化能力。以磷酸钙或磷酸二氢钙为主要原料,添加适量稳定剂、阻降剂,用熔铸拉丝法获得CPP纤维,并对其力学性能、降解性能、毒理学性能和生物相容性进行测定证明,这种材料可以作为骨组织工程支架材料[15]。我们实验室应用CPPf/PLLA/Ⅰ型胶原复合材料,按照不同的比例和方式制备的人工骨支架具有促进种子细胞粘附和增殖的作用(论文待发表)。Bujia等[16]选用多聚赖氨酸来包被PLA聚合物提高软骨细胞数,多聚赖氨酸除增加支架对细胞的吸附力外,还具有促细胞功能的作用。虽然PGA支架能促进种子细胞的粘附、增殖和分化,但是PLA、PGA降解后的酸性产物降低了聚合物周围的pH值,影响组织和细胞的粘附及生长。Agrawal等[17]采用碱性盐(包括碳酸钙、HA和碳酸氢钠复合PLA-PGA)来拮抗酸性降解产物对周围pH值的降低。Sims等[18]利用纤维蛋白单体在凝血酶作用下形成凝胶的天然过程制成纤维蛋白凝胶作为支架材料,这种聚合后的纤维蛋白凝胶具有生物相容性、可塑性好、吸附性强的优点,但其硬度远不能满足骨组织工程的需要。
3•3 细胞粘附的仿生材料研究
随着科学的发展,仿生材料的出现大大提高了材料的细胞亲和性,在材料表面加入化学基团,如羟基,改变了材料表面的湿润度,提高材料表面对细胞的吸附能力,将胶原类蛋白质固定在材料表面,设计出接近组织中的反应条件界面。因为粘连蛋白及其肽序如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是介导细胞与细胞外基质粘附的多肽连,在材料表面直接固定RGD序列可以促进受体介导的细胞对材料的粘附,RGD序列可被固有粘附蛋白受体特异性结合,在生物材料表面自发形成一分子层,为与受体介导的细胞反应提供了位点,进而促进细胞的粘附与伸展。Giglio等[19]把RGD序列固定在多聚吡咯后包被钛合金提高种子细胞的粘附及其成骨能力。双层膜与生物膜密切相关,因而以脂质膜介入,可提高材料表面的生物活性,引入荷电脂质、脂质聚合物和受体至双层可控制静电中:使聚合物具有一种类似锁钥(Lock and key)的力,这种修饰表面能调控材料表面与细胞间的相互作用[20]。从而,提高种子细胞在材料上的粘附和生长。
3•4 粘附因子介导粘附的研究
目前应用的促粘附因子既可以是转化细胞产生的纯化蛋白;也可以由骨基质或分泌细胞获得。无论来自培养基还是来自培养细胞自身分泌的