种子细胞一直是组织工程研究的核心问题之一,理想的种子细胞应该具有容易获得、容易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、抗原性小、组织修复能力强等特性。近年来,发现骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)基本具备上述条件,成为骨、软骨等组织工程中非常有应用前景的种子细胞,现将其最新研究进展综述如下。
1 MSCs的生物学特性
上个世纪70年代中期发现在骨髓标本中有小部分贴壁生长的细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落,后来证明这种细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种类型的细胞。这种具有干细胞特性、能够向多种中胚层组织分化的细胞被叫做MSCs。近年来,随着对这种细胞研究的深入,发现它有许多优秀的生物学特性:只需在局麻下穿刺抽取骨髓就可以获得自体MSCs,取材方便、机体损伤小、易于临床操作;在体外培养中具有贴壁生长的特性,易于分离纯化;体外培养可以多次传代并保持分化能力,易于扩增数量;来于自体,无须配型,无抗原性;具有干细胞的多向分化能力,可以分化成骨、软骨、肌肉、肌腱和脂肪等中胚层组织,适用于多种组织的修复重建;更新率低而代谢活力高,容易通过转基因技术获得目标基因并在体内外长期表达[1~3]。因此,MSCs可以作为骨、软骨、腱等组织工程较理想的种子细胞来源;也可以作为基因治疗中接受目标基因的优秀载体细胞;有人证实MSCs在体外培养时能分泌粒细胞集落刺激因子等造血系细胞因子[4],看来MSCs还可以用于造血系统疾病的细胞治疗;还有人尝试把MSCs用于动物脊髓损伤[5]和脑卒中[6]的治疗获得明显效果。这些特性使MSCs在未来的医学领域中具有不可限量的应用前景。
2 MSCs的分离纯化
MSCs分布广泛,胚胎时期存在于各种组织中,参与骨、软骨等组织的形成;成年后主要集中存在于骨髓中,骨膜、骨骼肌等组织也少量存在,在组织损伤修复的生理过程中有重要作用。即使在MSCs最集中的骨髓,其比例也非常小。Kadiyala[7]通过密度梯度离心筛选,认为狗骨髓中每2•5×104个有核细胞中仅存在1个MSCs,在培养皿中呈单层排列的纺锤体样(成纤维细胞样外观),体外培养时始终保持20%左右的细胞处于静止期,平均倍增时间是2 d,向成骨系方向发展可以被地塞米松所诱导。Zohar等[8]利用流式细胞仪分离马MSCs,认为未分化的MSCs具有体积小、核浆比大,不表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、碱性磷酸酶、骨桥接素等特征。除密度梯度离心和流式细胞仪之外,还可以利用MSCs在体外培养中贴壁生长的特性将其从造血系细胞中分离出来,因为此法简单有效成为目前分离MSCs最常用的方法[1~3]。
但上述3种方法都不能得到纯化的MSCs,其中混有一定的单核/巨噬系细胞、内皮细胞等,而对其研究和应用都需要纯化的MSCs,因此不少学者企图获得MSCs的特征性表面标记来筛选和鉴定MSCs。Pittenger等[1]观察了MSCs表面蛋白表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124,不表达造血系特征性标志CD14、CD34、CD45,证明了MSCs与造血谱系不是一类细胞。Conget等[9]利用流式细胞仪研究了人MSCs可能存在的多种表面抗原,发现对相应的抗体呈阴性的有CD1a、CD14、CD31、CD34、CD45、CD56和ESA。Cooper[10]用深低温储藏的MSCs在鼠移植模型中用反转录PCR方法观察人骨唾液蛋白(Bone sialo protein,BSP)和骨钙素(Osteocalcin)的表达,提示未分化细胞不表达BSP和骨钙素,但植入后3周可在部分标本检测出BSP的RNA表达,6周后从组织学上见到骨的形成并且每个标本均检测到BSP的cDNA,提示MSCs表面标志的表达在不同的分化过程中可能会有所不同。虽然经过大量努力,目前仍然无法分离出特异的细胞表面标志,从表面标志纯化、鉴定MSCs的方法还有待进一步研究。也有学者用单细胞克隆的方法获得纯的MSCs细胞株[1],即使这样得到的也是不同分化时期的MSCs,而且这种方法不便大量获得细胞。总之,目前尚无确切可行的方法来获得纯化的MSCs,培养贴壁法以其操作简单、成本低廉、对细胞损伤小的优势成为分离MSCs的主要方法。
3 MSCs的定向诱导分化
MSCs具有多向分化特征,具体向哪个方向分化是由周围微环境所调控的,在培养基中加入一定的诱导剂可以诱导MSCs向一定方向分化。近年来国内外对诱导剂进行了大量的研究,普遍认为糖皮质激素、维生素C、β-甘油磷酸钠[1]、维生素D[11]、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bF-GF)[12]、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)[13]及骨形态形成性蛋白(Bone morphogenic protein,BMP)[12]等能诱导成骨分化。TGF-β[1、13、14]、胰岛素样生长因子(Insulin-like growthfactor,IGF)-I[14]及整合素等能诱导MSCs向软骨方向分化,地塞米松、胰岛素、消炎痛[1]等能诱导成脂肪分化,成肌及成肌腱分化诱导剂有少量报道,但其研究工作很不成熟。这些诱导剂发挥作用的机制、诱导剂间的相互作用、最佳效量比和序贯应用的方法等问题目前尚无明确答案,最新的研究开始了这些方面的探索。
Kveiborg等[11]利用反转录PCR和RNA印迹技术检测用1,25-2羟维生素D3处理的MSCs中胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowth factor,IGF)mRNA含量,结果IGFs-Ⅰ、Ⅱ的mRNA量与1,25-2羟维生素D3无剂量相关性;而1,25-2羟维生素D3处理可以增加胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF binding proteins,IGFB-Ps)-2、3、4稳态mRNA的量,但与IGFBPs-5、6无关。认为1,25-2羟维生素D3所具有的抑制增殖、促进分化的作用,其机制可能与IGFBPs 2、3、4的表达有关。
Worster等[13]进行了不同浓度TGF-β1对马MSCs的体外培养中细胞增殖能力和Ⅰ、Ⅱ型胶原表达强度影响的量化研究,认为在5 ng/ml TGF-β1浓度作用下Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA的量分别是对照组的2•8和1•7倍,1 ng/ml组和10 ng/ml组均不及5ng/ml组明显,说明TGF-β1促进MSCs向骨和软骨方向分化的作用具有剂量依赖性,5 ng/ml是最适剂量。Worster等[14]进一步研究了马MSCs复合三维纤维蛋白支架分别序贯应用含5 ng/ml的TGF-β1和100 ng/ml的IGF-I的培养基体外培养能明显增加粘蛋白和II型前胶原的mRNA表达,但比软骨细胞培养对照组弱,提示TGF-β1和IGF-Ⅰ序贯应用可以增加MSCs向软骨方向的分化,但始终不能完全分化为软骨细胞。Hanada等[12]观察了地塞米松及bFGF作用下大鼠骨髓MSCs体外培养增殖和分化都明显增强了,地塞米松及BMP-2组仅轻微增加骨结节和钙含量,而地塞米松加bFGF和BMP-2组MSCs增殖和分化比上述两组都明显增强;把上述三组细胞分别复合多孔的磷酸钙陶瓷后体内实验也得到同样的结果。实验说明,单独使用BMP-2对骨髓MSCs成骨性能影响不大,但能放大地塞米松和bFGF对骨髓MSCs增殖和分化的促进作用。说明诱导剂间的相互作 用对诱导分化有显著的影响。
最近,Zhou等[15]用10-7mol/L的雌激素E2处理体外培养的鼠MSCs后,明显增强了雌激素受体(ER Estrogen Receptor)-α、ALP、I型胶原、TGF-β1、BMP-2的mRNA水平和表达量并促进了MSCs增生,减弱了ERβ的mRNA水平和表达并减少了细胞凋亡。在去卵巢骨质疏松小鼠和正常小鼠来源的MSCs都得到上述结果,由此可见,除细胞因子外,雌激素E2也能促进MSCs向成骨分化。
由此可见,多种细胞因子、激素和化学药物都对MSCs有诱导分化作用。这些诱导剂发挥作用的机制、诱导剂间的相互作用、最佳效量比和序贯应用的方法等问题的解决将对MSCs的推广应用起重要作用。
4 MSCs的载体
基因工程中载体的选择也是研究的重点之一,不同种类的该具备良好的组织相容性、适当的机械性能、合适的孔率、低免疫原性、体内无毒降解等条件,选择MSCs最适载体的研究工作取得一些进展。
Tang[16]比较了冻干松质骨和羟基磷灰石复合人MSCs在裸鼠皮下植入模型不同时期成骨的组织学差异,认为冻干松质骨明显比羟基磷灰石更有利于成骨。说明不同的载体对组织的修复效果有影响。Petite等[17]分别用珊瑚支架复合MSCs的组织工程骨、珊瑚支架复合红骨髓、及单独使用珊瑚支架修复
