摘要:通过溶胶—凝胶法合成制备了CaO-P2O5-SiO2系统溶胶—凝胶生物活性玻璃,并通过一定的烧结工艺将其制备成用作骨组织工程支架的多孔材料。采用生物材料的体外实验方法(in vitro)及DTA、XRD、SEM及FTIR等材料显微结构及性能研究手段分析研究了烧结温度对多孔材料的显微结构、生物活性和可降解性能的影响。
1 引言
在组织工程化人工骨的制备中,作为细胞载体的支架材料起到了十分重要的作用,特别是支架材料在生理环境中所表现出来的生物活性、可降解性能决定了在组织工程化人工骨的制备中细胞能否与支架附着良好,也决定了支架能否在新骨形成的同时本身逐渐降解,最后完全被新生骨组织所取代[1]。目前所采用的骨组织工程支架多为高分子材料,如:胶原凝胶、纤维蛋白、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)以及PLA/PGA共聚物(PLGA)等[2、3]。这类材料的优点为具有较好的生物相容性、可降解性及易如工性。其不足之处在于细胞亲和性和生物活性差,缺乏骨引导或骨诱导功能,降解速度不易控制,力学强度较低,不能很好地起到组织支撑作用。新型骨组织工程支架材料的研究和开发是生物材料研究领域的重要研究内容。本研究通过溶胶-凝胶法合成制备了CaO-P2O5-SiO2系统溶胶—凝胶生物活性玻璃,并通过一定的烧结工艺将其制备成用作骨组织工程支架的多孔材料。由于该材料所具有的无定形态结构特征及巨大的比表面积,使其具有较其它生物活性材料更好的化学反应活性、可降解性和细胞亲和性能,在制备骨组织工程支架方面具有很好的应用前景。此外,从制备工艺上来看,溶胶—凝胶合成步骤基本在室温下完成,避免了材料因高温挥发和污染而导致的组成波动和性能不稳定。材料的化学均匀性可达分子水平,使材料的质量易于控制。本研究还采用生物材料的体外实验方法(in vitro)及各种材料显微结构及性能测试手段分析研究了烧结温度对多孔材料的生物活性和可降解性能的影响。为进一步研制开发这类新型的骨组织工程支架提供了前期理论研究基础。
2 实验部分
2.1 溶胶—凝胶生物活性玻璃粉体的制备溶胶—凝胶制备工艺的基本原理是:将金属醇盐或无机盐经水解直接形成溶胶或经解凝形成溶胶,然后使溶质聚合凝胶化,再将凝胶干燥、焙烧去除有机成分,最后得到无机材料。此制备工艺一般包括:溶胶的制备、溶胶—凝胶转化、凝胶干燥等步骤。本研究制备的溶胶—凝胶生物活性玻璃的组成范围(mol%)为SiO255~65,P2O54~6,CaO 35~40。所用的原料为正硅酸乙脂、硝酸钙和磷酸三乙脂,盐酸作为催化剂。按照一定比例依次将每种原料加入烧杯后搅拌1h制成均匀溶液,在室温下陈化72h,使水解—缩聚反应充分进行,直到形成凝胶,将凝胶置于烘箱中于70℃和150℃分别烘干72h和48h,将干燥好的凝胶块在箱式电阻炉内于700℃热处理3h,制得细颗粒状溶胶—凝胶生物玻璃,将其在玛瑙研钵中研磨,过150目标准筛。取小于150目(<100μm)的粉末作为多孔材料的制备原料。2.2 溶胶—凝胶生物活性玻璃多孔材料的烧结温度制度图1 溶胶—凝胶生物活性玻璃的DTA(b)及DTGA(a)曲线烧结是粉料颗粒在高温作用下相互粘合并填充颗粒间孔隙的过程。在这一过程中,通常伴随化学反应和相变的发生。在高温下发生在单纯固体间的烧结成为固相烧结,而有液相参与的烧结则成为液相烧结。大多数硅酸盐系统(包括本工作所制备的溶胶—凝胶玻璃)粉末的烧结均为液相烧结。玻璃粉末的烧结是靠粘滞流动传质来完成[4]。为了探讨多孔材料的烧结温度制度,取过150目筛的溶胶—凝胶玻璃粉体(粒度小于100μm)作差热分析(DTA)和热差重分析(DTGA),测得DTA及DTGA曲线如图1所示。由图1b所示的DTA曲线可见,在168℃和499℃附近有两个吸热峰,对应于图1a的DTGA曲线中的两个热失重。这分别是由于试样中水分的排出及硝酸盐的分解所致。DTA曲线中310℃附近的放热峰也对应有热失重,是粉体中有机成分燃烧所致。997℃附近的微小放热峰未出现热失重现象,是由于玻璃析晶所致。根据上述分析,本实验制定了如下三种多孔材料的烧结方案以作比较:2.3 溶胶—凝胶生物活性玻璃多孔材料的制备为了比较不同烧结制度对多孔材料性能的影响,采用7%的聚乙烯醇作为粘结剂,与粒度小于150目(<100μm)的溶胶—凝胶生物玻璃粉体均匀混合,用钢模压型,制得直径10mm、厚度1.5mm圆片,置于通风厨内自然干燥,分别按照烧结方案1、2、3烧制成3种块状多孔材料试样,并将其命名为A1、A2和A3。2.4 材料的显微结构分析、生物活性及降解性能测试采用粉末XRD(D/max-wA型X射线衍射仪,日本)方法对烧结样品的主晶相进行分析鉴定。生物材料的生物活性是通过测定其在模拟生理溶液(SBF)中的表面碳酸羟基磷灰石(hadroxyl-carbonate-apatite,HCA)生成速度和生成量来进行综合评价的。HCA是人体骨组织的主要无机盐。本实验所用SBF溶液的pH值在7.25~7.40,所含各种无机离子浓度及缓冲能力与人体血浆基本相同[5]。本研究采用体外实验方法,将样品圆片以尼龙线悬挂于37℃恒温静态的SBF溶液中,样品表面积与溶液体积之比为0.1cm-1。利用SEM(H-800,日本日立公司)及FTIR(AVATAR 360,美国NICOLET公司)技术对反应不同时间的样品表面形貌变化、反应产物及反应机理进行了分析研究,以表征材料的生物活性;测定了浸泡不同时间材料的重量变化及浸泡溶液的pH值变化;采用诱导耦合等离子发射光谱法(Inductive Couple Plasma,ICP)测定了浸泡溶液的Ca浓度变化,以表征材料在生理环境中的降解性能。
3 结果与讨论
3.1 材料的晶相分析及SBF溶液浸泡不同时间的表面形貌和反应产物A1及A3样品的XRD图谱(图2)显示,材料中均有硅磷酸钙[Ca5(PO4)2SiO4或5CaO•P2O5•SiO2,5CPS]微晶析出,与A1相比,A3样品的衍射峰更为尖锐,衍射强度也较高,说明在较高温度下烧结,使材料具有更高的晶化程度,而A1样品则含有较多的玻璃相(A2玻璃的XRD图谱与A1基本相同,所以未列出)。(a)A1样品(b)A3样品图2 烧结后微孔材料的XRD图谱(可见A1及A3样品均有硅磷酸钙微晶析出)对A1、A2及A3样品表面的划痕试验显示,样品的烧结温度越高其表面硬度越高,这是由于样品粉料颗粒的连接程度及晶化程度均随温度提高而提高。图3所示的3种样品的红外漫反射图谱(FTIR)分析指出,A1、A2及A3三种样品在37℃的SBF溶液分别反应1、2和6天后其表面有HCA生成,说明3种样品均具有一定的生物活性。图谱中位于1040、800、560和601cm-1处的反射峰为HCA晶体形成标志[6、7]。由图3各FTIR图谱中HCA特征峰的高度可知,A3样品表面生成HCA所需时间较长,且形成HCA数量较少,说明其生物活性较A1、A2样品低。3种样品在SBF溶液中反应前后的SEM显微形貌分别见图4、图5及图6。反应前,3种材料中均存在由于玻璃颗粒间相互连接而形成的孔隙。这些孔隙对于增加材料的比表面积、提高材料与体液的反应活性和生物矿化速度,改善细胞与材料表面的亲和性,以及对细胞、毛细血管的长入具有重要意义。由图4、图5及图6可见,材料的烧结温度越高,材料中硅磷酸钙[Ca5(PO4)2SiO4或5CaO•P2O5•SiO2,5CPS]晶粒数量越多,材料的晶化程度也越高,这与XRD分析结果一致。图4、图5、图6为3种样品在模拟生理溶液(SBF)中37℃恒温浸泡不同时间的表面SEM形貌。由图可见,在SBF中反应一定时间后,3种样品表面均有HCA形成。比较图4b、图5b、图6b可见,在A1样品于SBF溶液中1天后其表面便形成大量的由叶片状HCA微晶构成的球形晶簇,HCA基本覆盖了整个材料表面,说明其具有较高的生物活性及生物矿化功能。这一性能对于细胞的附着及新生骨的形成非常有利。而含有较高硅磷酸钙(5CPS)(图6中的柱状晶体)的A2及A3样品表面在SBF溶液中分别反应2天和6天后才在其无定形玻璃基相表面形成HCA,而在5CPS微晶相表面未见HCA形成(见图5b、图6b)。这表明5CPS在SBF溶液中其结构是稳定的,在SBF溶液中不易发生化学反应,难以形成结构疏松的、含有大量≡Si-OH基团的硅酸凝胶层,不能诱导HCA晶核形成。因此,当材料中含有的晶相比例越高,HCA的形成则越少。由此可见,微孔材料的烧结制度对材料的晶体比例、结构特征、可降解性和生物活性具有重要影响。3.2 材料在SBF溶液中的降解性能及矿化机理分析图6为材料在SBF溶液中的重量变化曲线。其中重量变化按下式计算:△Ws=(Wo-Wt)/S⑴ 式中 △Ws—试样圆片在SBF溶液中的单位面积的重量变化,mg/cm2 Wt—浸泡不同时间的试样重量,mg Wo—试样未浸泡时的原始重量,mg S—圆片的表面积,cm2图9 A1、A2及A3样品在SBF溶液中的重量变化曲线材料在SBF溶液中所发生的表面化学反应源于溶液中的H3O+与玻璃表面的Ca2+发生离子交换。Ca2+的滤出及H3O+进入玻璃表面导致溶液中的Ca2+浓度升高(图7)及溶液中OH-相对浓度增高,从而使溶液的pH值也随之增高(图8)。同时,由于Ca2+进入溶液而使玻璃表面SiO2相对含量增高。伴随着H2O对玻璃≡Si-O-Si≡网络的断键作用,使玻璃表面很快生成结构疏松的含水硅酸凝胶层[Si(OH)4或SiO2•2H2O
