提 要:目的 构建一种新型压电甲胎蛋白(AFP)免疫传感器。方法 AT切向、基频10 MHz的石英晶体用金属夹具和乳胶套圈固定组成检测池,抗人AFP单克隆抗体采用巯基化方法固定在金膜电极表面制成抗体敏感膜,构成压电AFP免疫传感器。结果 构建的压电AFP免疫传感器对AFP的响应特性良好,其线性检测范围为20~1 000 ng/ml,癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)等对AFP的检测基本无干扰;传感器可再生后重复使用5次;68例临床标本检测结果与放射免疫检测法符合,两种方法的相关系数为0•92,P<0•01。结论 研制的压电AFP免疫传感器是一种灵敏度高、特异性好、不需标记、操作简单、省时、能重复使用和实时在线检测AFP的新方法,对比实验表明其检测结果准确,能用于临床实验诊断,具有临床推广价值。
甲胎蛋白(Alpha fetoprotein, AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白,成人由肝细胞产生,含量极微。血清AFP升高对肝癌有十分重要的诊断价值,是诊断原发性肝癌的重要指标之一[1,2]。目前AFP的临床检测方法有放射对流免疫法(RCIEP)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)等[3,4]。这些方法大多需要对抗体或抗原进行放射标记或酶标记,操作繁琐,耗时,检测成本较高。压电石英免疫传感器是一种以石英晶体为换能器的新型生物传感器件,其振荡频率对晶体表面质量负载的微小变化非常敏感,具有亚ng的质量检测能力,良好的响应性能和较高的检测灵敏度使其近年来获得了迅速的发展,成为免疫传感器的研究热点之一[5,6]。本研究以Sulfosuccinimidyl 6-[3′-(2-pyridyldithio) propionamido]hexanoate(Sulfo-LC-SPDP)巯基化固定法制备抗人AFP抗体识别敏感膜,构建了一种新型的质量效应型AFP免疫传感器,并初步应用于临床标本的检测,取得了良好的结果。
1 材料与方法
1•1 仪器与器材
石英晶振采用AT切型,双面镀金电极,基频10 MHz的石英晶体,晶振为13•0 mm×13•0 mm的方片,金膜电极直径为4•0 mm,晶振两面电极的接触点引在晶振的一面。检测池固定夹具具有与晶振尺寸相应的固定槽、电极接触膜及电极导线,上盖有直径6•0 mm的圆孔,夹具两端用螺丝固定;池壁为直径10 mm的乳胶套圈。频率检测仪采用自激式振荡电路,频率信号为TTL电平输出,检测室具有恒温、屏蔽、防震装置,由我室与中国嘉陵集团、信息产业部第26研究所共同设计制作。PCL-836多功能频率记数卡(台湾研发公司产品)内置于方正奔Ⅲ型计算机(北大方正集团公司)。我室自行设计开发的《PE-SA2•0频率采集分析软件》具有频率记数、差值显示、频率变化趋势图显示等功能。
1•2 主要试剂 抗人AFP单克隆抗体购自美国Biodesign公司(浓度为3•0mg/ml,PBS溶液pH 7•0);Sulfosuccinimidyl 6-[3′-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate(Sulfo-LC-SPDP)为美国Pierce公司产品;人AFP标准品采用ELISA免疫检测试剂盒的标准品(郑州博赛生物技术公司),由西南医院检验科张天晓老师惠赠。其他试剂均为AR级。
1•3 方法
1•3•1 石英晶体的预处理 按文献[7]报道的方法进行。氮气吹干后备用。
1•3•2 压电石英晶体传感器检测池的组装 把石英晶振放入金属夹具的晶振固定槽中,电极接触点向下放置与外接电极接触,抗体固定面向上,置入乳胶套圈和带金属的固定橡胶条,套上夹具上盖,旋紧固定螺钉,组装成压电石英晶体传感器检测池;外接电极与频率检测仪检测接口连接。
1•3•3 抗体的巯基化固定方法 抗体溶液3μl与等体积的Sulfo-LC-SPDP溶液混合,室温反应60 min,然后加入25 mmol/L的二硫苏糖醇(DTT) 2μl,混匀后室温反应30 min。上述巯基化抗体混合液全部转移至石英晶体金膜电极表面,均匀涂布,石英晶体在室温干燥。分别用0•15 mol/L的PBS缓冲液(pH 7•4)和双蒸水冲洗3~5次,氮气吹干,4℃冰箱保存备用。
1•3•4 检测方法 检测池置于频率检测仪检测室内,加入100μl检测缓冲液,37℃平衡片刻,检测记录液相基频f1;加入10μl不同浓度的AFP标准溶液,继续检测60 min,记录频率f2,频率偏移值Δf= f1-f2。标准曲线每个浓度点重复3次。并检测CEA、hCG、PSA等对免疫传感器的响应,观察传感器的非特异反应特性。
1•3•5 血清AFP的检测 方法同上。以PBS(pH 7•2)作为检测缓冲液,血清AFP浓度超过1 000 ng/ml时,需稀释后检测,共检测68例标本。
1•4 统计学分析
采用SPSS10•0统计分析软件进行t检验和相关分析。
2 结果
2•1 抗体工作浓度的选择
为了探讨巯基化法固定抗体时抗体的最适工作浓度,把浓度为3•0 mg/ml的抗体稀释成不同浓度的工作液。观察抗体浓度与抗体固定量的关系。结果表明巯基化固定抗体的量与抗体工作浓度密切相关,见图1。从图中看出,抗体的固定量随浓度的增加而增大,在抗体浓度达到3•0 mg/ml时,抗体的固定量最大。因购买的抗体浓度最高为3•0 mg/ml,无法观察更高浓度。因此,巯基化法固定AFP抗体,抗体工作浓度选择3•0mg/ml,以下实验均采用这一浓度。
2•2 压电AFP免疫传感器的响应特性
2•2•1 温度对传感器的影响 结果与文献[7]报道相符。在37℃时,抗原抗体反应后频率响应最大。当温度再升高时,频率响应却反而迅速减小。
2•2•2 抗原-抗体反应时间对传感器的影响 用制备好的压电免疫传感器检测AFP标准品,在37℃条件下观察晶体振荡频率随抗原-抗体反应时间的变化规律。结果显示,抗原抗体反应在40 min后,频率达到稳定,继续检测,频率降低已不显著。表明抗原抗体反应已基本达到平衡,免疫反应基本完成,再延长反应时间,晶体表面质量负载也无明显变化,频率达到稳定。因此,实验选择40 min作为检测AFP的反应时间。
2•2•3 AFP AFP
免疫传感器检测hCG、CEA、PSA高浓度标准溶液,上述条件反应40 min后,检测hCG、CEA、PSA所致传感器的非特异性频率响应值分别是(11•2±2•4)、(14•6±3•5)、(11•2±3•1) Hz。结果表明,上述物质引起的传感器频率响应均在传感器的噪音范围内[(13•8±3•6) Hz],对AFP的检测基本无干扰。可见,该传感器的选择性较好,特异性高,能满足临床检测的要求。
2•3 压电AFP免疫传感器检测标准曲线的制作
压电传感器在AFP各浓度点的频率变化值(Δf =f1-f2;f1为检测液相基频)用3次平行检测结果的平均值表示,并用参考检测值进行校正。以AFP标准溶液的浓度为横坐标,频率变化的绝对值(Δf)为纵坐标作图,得到AFP压电免疫传感器的检测剂量反应曲线。AFP的浓度在20~1 000 ng/ml范围内,AFP的浓度与传感器频率的变化之间呈良好的线性关系,AFP浓度低于20 ng/ml时,传感器频率的特异性响应信号易被噪声信号淹没,因此,20 ng/ml是传感器的最低检测限。
2•4 初步临床应用
利用构建的压电AFP免疫传感器检测了68例临床血清标本。同时,采用放射免疫分析法进行平行检测,结果经线性相关分析,两种方法的相关系数为0•92(P<0•01),表明本法检测结果与放射免疫分析法高度符合。
2•5 压电
