本文是一篇农业论文，本研究使用荧光显微镜和流式细胞术对CFDA-SE荧光探针对子孢子的标记情况进行分析，结果显示，标记的子孢子与MDBK细胞共孵育2小时后，仍能通过流式细胞术在MDBK细胞中检测强烈的荧光信号，由此，我们成功建立了方便且客观衡量子孢子入侵MDBK细胞的效率的检测方法。
1 前言
1.1 鸡球虫病概述
1.1.1 鸡球虫病的危害
鸡球虫病是由一种或多种球虫引起的肠道疾病，对鸡的健康和生产性能造成严重的危害，感染鸡出现肠道吸收障碍、肠炎等症状，严重时甚至死亡。鸡是全球最主要的经济动物之一，也是人类重要的肉类和蛋类来源。据统计，2018年全世界鸡的总养殖量超过680亿只，占全球肉类产量的三分之一。球虫病在雏鸡中的发病率可以达到50 %~70 %，死亡率甚至能够达到80 %。鸡球虫病曾被列为英国（UK）家禽三大疾病之一，每年造成超过10亿美元的经济损失[1]。
1.1.2 鸡球虫的种类及生活史
目前已知可以感染鸡的艾美耳球虫共有七种，虽然寄生部位和致病性不同，但其生活史大致相同[2]。排出体外的新鲜卵囊不具有感染能力，需要在适宜的温度、湿度和氧气等适宜的条件下进行孢子化后才能形成具有感染力的卵囊。有文献报道，孢子化卵囊在外界可以存活602天，而未孢子化卵囊仅可以在宿主的肠道中存活约7个月[3]。孢子化的卵囊经口进入鸡体内后，经过肌胃的研磨，卵囊壳破碎，孢子囊释放。经化学刺激（消化酶和胆汁的消化作用）后，每个孢子囊中释放2个子孢子。游离的子孢子进入细胞后移位到细胞核处，在寄生液泡（PV）内发育圆形的滋养体。滋养体经过多次无性生殖分裂生成裂殖体，感染后3天左右，成熟的裂殖体会破裂产生数十个裂殖子，即Ⅰ代裂殖子。Ⅰ代裂殖子会破坏细胞并逃逸到肠腔中，逃逸过程会使细胞受到严重的损伤。进入肠腔的Ⅰ代裂殖子再次侵入肠上皮细胞后，进行二次生殖以增加裂殖子的数量，为有性生殖阶段提供基础，该阶段在顶复门寄生虫生命周期中至关重要。感染第6天时，第二代裂殖体成熟并释放出Ⅱ代裂殖子。此时，裂殖子开始进行有性生殖，其中大部分发育成大的单核的无运动性的大配子体，另一部分进行有丝分裂，发育成大的多核细胞即小配子体。小配子体会再次分裂产生多个带有两个鞭毛的纺锤形细胞，称为小配子。当小配子遇到大配子体后，会主动与大配子结合产生合子，合子形成后会迅速发生变化，形成卵囊壁。感染7天左右卵囊随着粪便排出体外，卵囊排出体外后进入休眠状态并在适宜环境下发生孢子化，再次被鸡吞食后进入下一轮生活史。
1.2 抗球虫感染的免疫应答机制
1.2.1 体液免疫
在早期研究中发现，鸡感染艾美耳球虫9~20天后，可以在鸡血清、胆汁和肠道分泌物中检测到大量的特异性IgM、IgG和IgA 抗体，这些抗体能够有效地防止再次感染，并且与艾美耳球虫的种类有关[5]。研究人员采集感染球虫后的IgG 抗体对雏鸡进行免疫，结果发现，能够对雏鸡的攻虫感染提供高达97 %的被动免疫效果[6]。此外，垂直传播母源IgG 抗体可以提供高达100 %的保护率，并且可以预防同源感染[7]。Berezin VE等（2010）使用含有球虫抗原和低毒性植物皂苷的复合物免疫雏鸡，可以刺激机体产生特异性血清IgG 抗体，激发保护性免疫应答，使雏鸡能够抵抗E. tenella的入侵[8]。王礼跃等（2022）在研究中尝试使用E. tenella大配子体的抗原免疫雏鸡后，可以在鸡血清中检测到特异性抗体产生，提供一定的免疫保护效果[9]。这些结果表明，体液免疫产生的IgG 抗体能够在对抗球虫感染过程中发挥一定的作用。
艾美耳球虫的生活史主要在盲肠的黏膜和黏膜下层完成，因此在抵抗球虫感染过程中，黏膜免疫是第一道防线。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是鸡体内分泌到肠腔的主要抗体，sIgA具有抗原特异性免疫功能，在控制病原体和毒素方面发挥重要作用。Davis等（1977）揭示了感染E. tenella后，在盲肠内容物中可以检测到针对裂殖体和子孢子的特异性sIgA，能够有效阻止寄生虫入侵宿主细胞[10]。Bun等（2011）发现膳食补充有机锌可提高盲肠的sIgA抗体水平，显著减少粪便中卵囊排出的数量，对E. tenella感染具有保护作用[11]。尽管肠道IgA对球虫感染的具体作用机制尚不清楚，但Yun等（2000）认为sIgA可能附着在球虫表面通过直接阻断、诱导构象变化以及降低运动性等方式阻止其与上皮细胞的结合[12]。此外，sIgA还可能直接作用于子孢子或裂殖子，以限制球虫的发育并阻止球虫损伤宿主细胞。
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物和鸡球虫虫株
实验中所使用的实验动物和寄生虫见表2-1
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌表达EtMIC2蛋白
2.2.1.1 目的基因EtMIC2的合成
EtMIC2基因全长1041 bp，通过公司合成并基因两端插入酶切位点BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ。最后得到的样品为大肠杆菌Top10穿刺菌（内含pU C57-EtMIC2质粒）。
2.2.1.3 pUC57-EtMIC2质粒提取
为了获得pU C57-EtMIC2质粒，首先将Top10/pUC57-EtMIC2于LB液体培养基中扩大培养，根据质粒小提试剂盒说明书提取pU C57-EtMIC2质粒。 质粒提取步骤如下：
（1）将菌液12,000 rpm离心1 min，去除培养基； （2）使用1 mL无菌PBS洗涤菌体，以去除培养基残留； （3）向EP管中加入250 μL的溶液Ⅰ，悬起沉淀； （4）向EP管中加入250 μL的裂解缓冲液Ⅱ，轻轻翻转使其充分混合； （5）加入250 μL溶液Ⅲ，随后12,000 rpm室温离心10 min； （6）小心吸取上清并转移到BL平衡液平衡后的CPⅢ吸附柱中，离心弃去废液； （7）使用PW漂洗液清洗两次后离心以去除残留； （8）将吸附柱敞口放置于通风橱中约10 min使残留的乙醇挥发； （9）使用预热的EB进行洗脱，产物（目的质粒）于-20 ℃条件下保存。
3 结果 .................................... 35
3.1 基因EtMIC2 在大肠杆菌中的诱导表达 ............................. 35
3.1.1 重组质粒 pET-30a(+)-EtMIC2 的 PCR 和双酶切鉴定 ...... 35
3.1.2 目的蛋白EtMIC2 的诱导表达及纯化 .................................. 35
4 讨论 ................................... 55
4.1 EtAMA1、EtIMP1、EtMIC2 和 Et3-1E 四种蛋白的抗原性研究 ................................. 55
4.2 递送鸡球虫抗原的重组粪肠球菌表达体系 ................................ 56
4.3 表达鸡球虫蛋白的重组粪肠球菌诱导机体免疫应答 ................ 57
5 结论 ................................. 61
4 讨论
4.1 EtAMA1、EtIMP1、EtMIC2和Et3-1E四种蛋白的抗原性研究
E. tenella侵袭宿主细胞过程中涉及多种蛋白的参与，EtAMA1蛋白是艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞的关键蛋白，也是一种有效的抗原。EtAMA1是一种I型跨膜蛋白，包含信号肽、跨膜区、胞外区、C端细胞质区和AMA1超家族结构域[60]。EtAMA1还含有16个保守的Cys残基，它们位于胞外区域，并参与二硫键的形成[81, 82]。研究表明，EtAMA1蛋白定位在子孢子的顶端，在入侵过程中被分泌到胞外[83]，而且该蛋白在子孢子时期表达最高，表明在入侵过程中发挥重要作用[84]。此外，有研究表明，使用抗体、重组蛋白或多肽阻断EtAMA1能够显著降低宿主细胞中的E. tenella子孢子数量，也侧面反映了EtAMA1在入侵过程中发挥了重要的功能[83, 85]。EtAMA1蛋白还具有良好的抗原性，Li（2018）等将EtAMA1蛋白锚定在乳酸乳球菌的细胞壁上表达，可以有效激活机体免疫，提高血清IgG 抗体水平，产生有效的抗球虫免疫应答，卵囊排出率也有显著降低[61]。Liu等（2020）通过给鸡口服免疫表面表达EtAMA1蛋白的重组植物乳杆菌，结果表明，可以提供一定的抗球虫免疫保护效果[86]。以上研究结果表明，以EtAMA1蛋白作为抗原，开发重组疫苗具有良好的应用前景。
IMP1蛋白是一种有效的E. tenella疫苗抗原，已经有大量的文章报道将IMP1作为抗原免疫雏鸡，可以提供良好的免疫保护效果。2013年，IMP1首次被鉴定为E. tenella的新型疫苗抗原，使用重组EtIMP1蛋白免疫鸡后对免疫保护效果进行评估，研究发现与未免疫的鸡相比，免疫rE tIMP-1的鸡的盲肠中虫体数量减少了67 %[87]。此前，Yin等[88（]2014）报告显示，用全rE tIMP1或EtIMP1的C端衍生物免疫后雏鸡后，卵囊输出量减少了60~66 %。Krishnendu等（2020）使用定量PCR测量盲肠中寄生虫基因时发现，接种rE tIMP1的鸡盲肠中的寄生虫基因比未免疫对照组相比减少67 %，而且接种rE tIMP1的鸡血清中IgY抗体水平以及IL-4的水平也显著升高[89]。
5 结论
（1）表面展示EtAMA1、EtIMP1、EtMIC2和Et3-1E蛋白的四株鸡源重组粪肠球菌口服免疫雏鸡后能够激发针对目标蛋白的特异性免疫应答。
（2）不同组合的
