摘 要 1990年Landsteiner发现ABO血型,并被用于遗传学,为解决亲子鉴定问题奠定了一定的基础。但在过去进行亲子鉴定所检测的遗传标记多为基因产物,即蛋白质。随着分子生物学理论与技术的飞速发展,用于亲子鉴定的方法也由血型检验发展到了DNA技术,发生了从蛋白质到基因、从排除到肯定的质的飞跃。目前,用于法庭科学的DNA技术较多。本文采用新近发展起来的STR基因扫描分析技术,通过对TH01、TPOX、CSF1P0、D3S1358、VWA、FGA、D5S818、D13S317、D7S820等9个STR位点和Ameloginin基因的多态性同步检测分析,进行了2例亲子鉴定,来说明基因扫描技术在亲子鉴定中的作用。
1 材料与方法
血样均取自西安交通大学医学院法医系实验室既往检案积累。(1) DNA提取取全血50ul,用盐析法提取DNA,经乙醇沉淀后,加去离子水100ul后备用。(2) PCR扩增反应总体积为12ul,其中含样本DNA5ul, Master Mix 7ul。在PE9700上先95°C热变性11min,后接94°C1min, 59°C1min, 72°C1min;最后60°C10min,于4°C下保存备用。(3)电泳先取1ulDNA样本与1•3ulFLS/GS上样染料混合,在95°C变性2min,然后取1•5ul上样至6%的变性聚丙烯酰胺凝胶,进行电泳分离。在电泳胶板两边的上样槽内各加1•5ul等位基因标记物。电泳条件:时间120min、功率200W、电流60mA、电压3•0KV。(4)基因扫描采用Genescan分析软件,把电泳收集的图谱信息经过计算机处理成数据信息,这些数据信息与设计分子大小标记的内标比较并被定义。(5)基因分型采用Genetuer分析软件,按照分厢法并根据每个等位基因重复序列出现的次数进行命名。
2 结果与讨论
2•1 案例资料案例1:王某与许某于1995年10月结婚,次年11月妻子许某剖腹产一男婴,由于婚后夫妻关系不睦,经常吵闹,且丈夫王某怀疑孩子非其亲生,故要求进行亲子鉴定。案例2:徐某与陈某于1996年8月结婚,并于1997年9月生一女婴。因婚后丈夫徐某经常外出,加之传言妻子与他人关系暖昧,故怀疑孩子非其亲生,要求进行亲子鉴定。对以上2例亲子鉴定,通过ABO、MN、Rh、EsD、HP、HLA-A、B、DR以及LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和GC等遗传标记进行检测,发现案例1在所有的血型系统中,父亲王某与孩子的各种遗传标记均符合血型遗传规律,经计算相对父子关系概率(RCP)为99•84%。而案例2分别在HLA-A、D7S8、GC与MN、HLA-B和HBGG各三个系统中发现,父亲徐某与孩子的遗传标记不符合血型遗传规律。对2例案件,作者又采用STR基因扫描技术,进行了TH01等10个基因位点的分析检测,结果(见表1, 2)发现,案例1中父亲与孩子的各种标记同样符合遗传规律,经计算RCP分别达到99•9959%。而案例2分别在TH01等5个基因位点中,父亲与孩子的基因型不符合遗传规律。因此,可以断定,案例1中的孩子为父亲王某亲生,而案例2中的孩子与父亲徐某无生物学父子关系,即不是其父亲生。2•2 亲子鉴定的原理亲子鉴定的基本原理是应用遗传特征及其遗传规律进行的,孩子的遗传标记一定来自父母双方,即一半来自父亲,一半来自母亲。很显然,检测的血型系统越多,非亲生父亲被排除的机会就越大,亲生父亲的可能性就越大。排除亲子关系可以根据血型的遗传规律做出肯定性结论,而肯定亲子关系,却只能从相对亲子关系概率来推测。按照国际标准, RCP达到99•50%以上时,基本可以认定亲子关系,如果RCP达到或超过99•73%则可以肯定有亲子关系。因此,要保证亲子鉴定结论的准确性,就要尽量多地检测各种遗传标记,并且应选择多态性高的血型系统。
3 实验结果
按照上述方法,检材的检测结果较理想。2个亲子鉴定案例中每个人的10个基因位点检测结果。系统TH01、VWA、FGA、D13S317、D7S820中,父子的遗传标记不符合遗传规律,所以不存在生物学上的父子关系。由此可见, STR基因扫描技术的应用价值很大。因为每个人在遗传上是不同无忧论文网的,不同的本质不是在基因产物上,而是在基因本身,即DNA水平上的差异。传统上进行亲子鉴定,几乎都是对基因产物—蛋白质的检测。由于基因产物在表达过程中会受到生理、病理,甚至环境等多种因素的影响,而且这些血型系统的多态性也较低。据有关资料报道,进行亲子鉴定时,如果只测ABO、Rh、MNSs等血型系统,否定父亲的几率只有60%左右,即使加上HLA-A、B、C、DR以及几种血清型与红细胞酶型,也只能达到98•95%,加之检测这些遗传标记的技术复杂,实验耗时长,因此在实际应用中存在很多问题。人类基因DNA中,存在大量具有高度多态性的STR位点,其等位基因一般在100~350bp,是目前理想的DNA遗传标记。在进行亲子鉴定因素的影响和个体识别时,通过对STR基因位点的检测分析,不仅可以避免各种生理、病理等对个体识别的影响,而且可以大大提高父亲排除率和个体识别力。本文中的9个STR位点在中国汉族群体中的父亲排除率为0•9998,个体识别力达到1•05×10-10。而且这些位点可同步检测,加上Ameloginin性别基因,既可以进行个体识别,又能确定性别,与传统的性别鉴定方法有本质不同。同时该方法在实验中不但设立了各种质控标准,而且用专门的仪器和软件进行分析,确保了实验结果的准确性,非常易于标准化。因此, STR基因扫描技术在法医学亲权鉴定和个体识别中是一种快速、准确而有效的方法,同时,也将为人类基因组研究、基因诊断、生物考古等领域的研究开辟一条新途径。
参考文献
1 李生斌•基因扫描与应用•新世纪科学论坛•西安:陕西科技出版社, 1999; 365
2 Tomas JH•An STS-Based map of the human genome. Science, 1995 (22): 270
3 Colette D•A comprehensive genetic map of human genome based on 5264 microsatellites. Nature, 1996; 380:14
4 Jeffrey R•S•Major susceptibility locus for prostate cancer on chromosome 1 suggested by a genome wide search.Science, 1996 (22): 274
