【摘要】目的 建立PCR-RFLP技术检测mtDNA序列多态性的方法,调查武汉汉族人群mtDNA HV-Ⅰ区段限制性片段长度多态性,并对PCR-RFLP技术在毛干、指甲等生物检材的个体识别案件中的应用进行评估。方法 应用nest-PCR技术和RFLP技术建立检测mtDNAHV-Ⅰ区段限制性片段长度多态性的方法,调查150例武汉汉族人群无关个体,同时对实际案件中的毛干、陈旧骨骼、水浸血痕等不同种类、不同保存时间和条件的生物检材进行检测。结果RsaⅠ酶切检出4种表型,频率分别为0·760、0·167、0·066和0·007,遗传差异度(GD值)为0·393,随机匹配概率(P值)为0·607。应用PCR-RFLP对毛干、20年陈旧骨骼、水浸血痕进行了检测以及在个体识别及母子关系亲子鉴定案例中应用。结论 用PCR-RFLP法检测mtDNA序列多态性在法医物证检验中具有应用价值。
【关键词】法医物证学 mtDNA 多态性 PCR-RFLP RsaⅠ酶
A study on genetic polymorphism ofm tDNA by PCR-RFLP and applications in forensic practice/
【Abstract】ObjectiveTo develop a method of sequencing mitochondrialDNA(mtDNA)using PCR-RFLP bywhich the genetic polymorphism ofRFLPs inHV-Ⅰregion of themtDNAwas studied in populationofHan nationality and evaluate applicability of themethod by investigating theRFLP ofmtDNAHV-Ⅰwithsamples such as hair shafts and fingernails.M ethods15997-16401nt region of themtDNA in 150 unrelatedindividuals ofHan population inWuHan areawas amplified by PCR.The PCR productswere digested byrestriction endonucleaseRsaⅠand electrophorezied by PAGE, followed by silver staining.Using PCR-RFLPmethod,we have genotypedmaterialsuch ashairshafts, old bone http://www.51lunwen.org/fayixue/fragments,water-immersed blood stains andsamples preserved under various conditions.ResultsAmong the 150 unrelated individuals, 4 genotypesweredetected using restriction endonuclease RsaⅠ. The genotype frequencies were 0·760, 0·167, 0·066 and0·007, respectively.Genetic diversity(GD)was 0·393 and random match probability(P)was 0·607. Themethod was also successfully applied to the genotyping ofmtDNA in hairshafts, bone fragmentspreserved for20 years andwater-immersed bloodstains and in cases ofpaternity testing.ConclusionThe gene haplotypingofmtDNA by PCR-RFLP are applicable to cases in forensic science.
【Key words】Forensic physical evidence;MitochondrialDNA(mtDNA); Polymorphism; PCR-RFLP;RsaⅠ
线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)是唯一的核外基因组DNA,由于mtDNA的结构特征、序列多态性、母系遗传特征等在法医学上具有应用优势,成为个体识别的主要补充手段。目前mtDNA分型检测大多采用PCR直接测序法,国内报道对HV-Ⅰ的15997-16401nt测序分析,该法要求有测序仪及相应的试剂盒,费用昂贵,操作费时,且对操作人员本身素质要求高,在基层难以开展。而本法旨在探索一种简便实用的方法检验mtDNA的多态性。
1 材料和方法
1·1 样本150份武汉地区汉族无关个体EDTA抗凝血,由武汉市商业职工医院检验室提供; 10份毛干由武汉市公安局刑侦处日常案件收集;武汉市公安局刑侦处日常案件积累的1、3、10、20年骨骼各2份;两个体的血、头发、脑、牙齿、骨骼、肌肉组织取自武汉市公安局刑侦处案件解剖材料; 10例亲子鉴定案及10例个人识别案取自武汉市公安局刑侦处日常检案。
1·2 方法
1·2·1 DNA提取 血液、血痕、毛根样本用Chelex-100法提取;脑、牙髓、肝、肾、肺、脾、肌肉等组织匀浆后,用细胞裂解/蛋白酶K DNA提取法;毛干、指甲的DNA提取应用二步PK消化法;骨骼DNA应用CTAB裂解及磁珠试剂盒纯化法。
1·2·2 PCR扩增 采用法医学论文巢式PCR(Nest-PCR)法,扩增的两对引物序列如下: 15965-16491ntF 5′-CCAAG-GACAAATCAGAGAAAA-3′, R5′-GTAGGAACCAGAT-GTCGGATA-3′; 15997-16401nt F5′-CACCATTAGCAC-CCAAAGCT-3′, R5′-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3′;二次扩增体系中的引物浓度均为0·5mol/L;循环参数:第一步扩增循环参数为96℃×2min×1cycle; 94℃×30s, 56℃×30s, 72℃×70s共25cycles; 72℃×7min×1cycle;第二步扩增循环参数为96℃×2min;94℃×30s, 58℃×30s, 72℃×80s共35cycles; 72℃×7min×1cycle。
1·2·3 PAGE电泳检测扩增产物 PAG成分为T5%、C 3%,凝胶大小为230mm×170mm×0·5mm,电泳缓冲液为0·5×TBE,电泳条件为恒压200V,电泳20min,银染显带。
1·2·4 RFLP分析 酶切反应体系总体积为20μ,l限制酶浓度为0·25μ/μ,l反应条件为37℃水浴1h。
1·2·5 PAGE电泳检测PCR-RFLP分型产物 凝胶成分为T 6%、C 3%,胶中含4mol/L的尿素,凝胶大小为230mm×170mm×0·5mm,电泳缓冲液为0·5×TBE,电泳条件为恒压300V,电泳2h,银染显带。
1·2·6 统计分析 记录150份无关个体的RsaⅠ酶分型结果,依据文献[1]计算各表型的频率、GD值及随机匹配概率。
2 结 果
2·1 PCR扩增结果150份无关个体的血样mtDNA D-环15997-16401nt区域进行PCR扩增,均可见大小为405bp的扩增片段,见图1。
2·2 RFLP结果检测150份血样中共检出4种表型,分别自命名为A、B、C、D型(图2),单倍型频率见表1。酶切后,A、B、C三型各为5条谱带,A型谱带大小分别为53、76、80、91、98bp; B型谱带大小分别为53、76、80、91、112bp;C型谱带大小分别为53、76、80、91、193bp。D型为4条谱带,大小分别为53、76、91、245bp。武汉汉族人群的GD值为0·393,P值为0·607。
2·3 PCR-RFLP分型mtDNA的法医学应用研究本实验对毛干、骨骼进行了检测,均得到清晰图谱;对两个个体的心、肝、脑、肾、肺进行检测,同一个体不同组织均可见相同的RsaⅠ-RFLP分。图3为日常检案所积累的10份毛发检材应用RsaⅠPCR-RFLP方法分型所得图谱。
3 讨 论
mtDNA进化比核DNA基因序列快6~17倍,mtDNA D-环长1 122 bp,是mtDNA中唯一不编码的核苷酸片段,无修复系统,不受选择压力的影响,因此变异的积累也最多,其中又以起始的500bp内变异为显著[1];DNhttp://www.51lunwen.org/fayixue/A序列中单个碱基的突变可以使序列中出现新的限制酶识别点或者原有的识别点消失[2]。
基于以上原理,本文选择一对特异引物扩增mtDNAD-环内的15997-16401nt区段,获取足够检测模板,再以限制性内切酶RsaⅠ进行酶切。限制酶RsaⅠ的识别点是5′-GTAC-3′,所检测的个体mtDNA区段含有该识别序列,该处便被切断,无A则保持完整,以达到个体识别的目的。本文选择的PCR技术,限制酶酶切技术均为成熟技术,与m
