提 要:目的 通过对死后5~36 h脑细胞降解后残存DNA含量的定量分析来推断其早期死亡时间。方法 选取32例已知死亡时间的人体脑组织,在死后5~36 h内每小时进行细胞学涂片、Feulgen-Vans染色,采用图像分析技术检测反映脑细胞核DNA含量的平均光密度、积分光密度、平均灰度等灰度参数,分析脑细胞残存DNA的含量与其对应的死亡时间的变化规律。结果 在5~36 h内平均光密度、积分光密度随死亡时间的延长而逐渐减小、平均灰度逐渐增大,且其均值均与死亡时间显著性相关,并得出对应的回归方程。结论 反映人脑细胞DNA含量改变的灰度参数均与死亡时间有明显的相关性,是推断早期人体死亡时间的有效的定量指标。
关键词:法医病理学 早期死亡时间 DNA降解 图像分析
Changes of DNA content of human brain cells in different postmortem interval by im-age analysis
Abstract:Objective To analyze changes of DNA content in human brain nuclei and seek a new experimentalmethod to deduce the postmortem interval (PMI) by computer image-analyze technique.Methods The brain tissuefrom32 cadavers with the accurate PMI, was sampled and smeared respectively every hour within the first 36 h afterdeath, fixed with cold Carony fixation, stained by Feulgen-Vans method. Three detective indexes of DNA in brain nu-clei were detected by using the image-analyze instrument, including integral optical density (IOD), average opticaldensity (AOD), average gray (AG).Results IOD and AOD in the human brain nucleihttp://www.51lunwen.org/fayixue/ declined regularly with theprolongation of dead time in 36 h,whereasAGrose.Therewas a definite relationship betweenPMI andgrayparameters(IOD, AOD and AG).Conclusion Gray parameters (IOD, AOD and AG) were proved to be preferable indexes tostudy the DNA degeneration rate of the brain nuclei in 36 h after death and estimate PMI accurately.
Key words: forensic pathology; postmortem interval; DNA degradation; image analysis
人体死亡时间(postmortem interval, PMI)的推断一直是法医病理学的重要课题,尤其死亡早期时间的推断在刑事侦查中对犯罪嫌疑人的排查、死亡医疗纠纷的仲裁等司法实践中更具重大的现实意义。尽管已有根据早期尸体现象、胃内容物消化程度、生物物理学、组织化学、免疫组织化学等多种方法来推测早期死亡时间,但目前尚无精确、可重复的实用方法。本研究在前期动物实验的基础上应用图像分析技术探讨死后5~36h人脑细胞残存DNA含量与早期死亡时间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料选择湖北地区2001-2003年具有确切死亡时间的32例尸体,其中颅脑损伤致死者27例(84·37%),窒息2例(6·25%),猝死3例(9·38%);男性29例(90·62%),女性3例(9·38%);年龄18~54岁,平均年龄31·5岁;尸体保存于16~25℃的环境中,取材的实验环境温度在17·5~25℃。首次取材时间均在死后5 h内进行。
1.2 取材、涂片无菌手术条件下取出完整的脑组织,将脑组织置于含200mg/L庆大霉素的生理盐水中,18℃冰箱中存放0·5 h,经抑菌处理后将其移入无菌洁净的保湿盒内(保湿盒为密封钢盒,用生理盐水浸湿的纱布垫底,钢盒使用前经常规高温灭菌处理),每隔1 h剪取1 cm×1 cm×2 cm样品1份,剪取部位(保证该处无生前创伤、明显淤血)统一为颞上回的脑膜下0·1~0·5 cm处(大脑皮质区)。样品浸入清水摆动洗涤10次,清洗血浆成分及血细胞,取出后滤纸吸干,均匀地轻力直线涂片。涂片后立即固定于冷Carnoy固定液中0·5 h,自来水冲洗5 min。室温晾干避光置于4℃冰箱备染或保存。
1·3 染色对图像分析组帮写论文的备染涂片统一进行Feulgen-Vans染色,试剂配制及步骤均参照文献[1]介绍之方法并略加改进。
1·4 图像分析采用Motic Med 6·0 CMIAS彩色病理图像分析系统,统一对染色后的涂片进行测量分析。测量分析由专人完成,要求其必须是受过图像分析技术培训合格的病理学主治医师(相当或以上职称),确保图像分析的规范。每次采集前均设置相同的系统环境。每张涂片高倍视野下以“弓”字形状作为采集线路(保证采集的图像无重复、交叉)取15个视野,每个视野采集一幅图像。通过模数转接通道数字化后以CMP及BMP格式分别将图像存盘并备份。
再从每幅图像的左上角开始以“弓”字形状随机选取10个孤立、分离的脑神经元细胞(以星型细胞为主:因为大脑皮质的神经元以颗粒细胞数量最多,颗粒细胞中星型细胞最多见),保证每幅图像采集的细胞无重复、交叉,进行积分光密度(integraloptical density, IOD)、平均光密度(average optical density, AOD),平均灰度(average gray, AG)测量分析,获得相关的对应数据。
每小时分析的细胞数=32例×1张切片×15视野×10细胞=4 800细胞。测量时每次重新开启图像分析系统后均进行尺度定标、光密度定标。所有操作程序的步骤、次序一致。
1·5 统计学处理所测数据用SPSS 10·0软件进行线性回归和多元回归分析。
2 结果
2·1 脑细胞各灰度参数的测量值死后5~36 h内每个死亡间隔点即每小时脑细胞各灰度参数均取该死亡时间对应点所测细胞的均值结果(表1)。
2.2 人体死亡5~36 h脑细胞核各灰度参数变化趋势死后5~36 h人脑细胞核的灰度参数随死亡时间的延长AG呈上升趋势, AOD、IOD呈下降趋势。
2.3 各灰度参数的线性回归分析各灰度参数(AOD、IOD、AG)均与PMI存在显著的相关性(P<0·01),见表2。
2.4 灰度参数多元线性回归分析多元回归分析显示灰度参数整体上亦与PMI存在显著的相关性,其多元回归方程见表3。
3 讨论
人体死亡时间推断的传统方法是根据早期尸体现象、超生反应、尸体化学测定等推断早期死亡时间易受外界因素影响,带有一定的主观性、经验性。如尸冷被认为是死后24 h内推断死亡时间最有效的单因素指标,但由于机体死亡时的体温可能高于或低于37℃,且不同条件下的环境温度迥异,尸体冷却的速度并不均衡一致,故而要求其精确地推断死亡时间极为困难[2]。
近10年来本课题组尝试应用计算机图像分析技术,通过对不同PMI的细胞核DNA降解后残存含量的定量分析来推断死亡时间。前期动物实验表明大鼠死后细胞核的DNA含量变化与PMI存在相关性[3,4]。本研究在前期基础上首次以人体材料为对象对不同PMI的人脑细胞DNA含量进行图像分析。结果显示在死后5~36 h内所选灰度参数(IOD、AOD、AG)均值均与PMI有统计学相关性,且得出灰度参数多元线性回归方程及各参数的线性回归方程;在死后5~36 h内IOD均值随PMI的延长呈下降趋势,R2为0.976,其中在6~13 h内IOD均值下降最快;AOD均值亦呈下降趋势,R2为0.983,其中在10~17 h内AOD均值下降最快;AG均值呈上升趋势,R2为0·987,其中在29~36 h内AG均值上升最快。本研究首次检材涂片时间为死后第5小时,由于尸体标本具有一定的特殊性,样本在完成相关法律程序后,实验起始时间难以统一控制在0~5 h内,故无死后0~5 h的完整实验数据,但前期实验表明0~6 h大鼠脑细胞DNA降解呈平台现象[4]。
本研究选取IOD、AOD、AG等灰度参数分别从被测目标的像数点光密度状况、单色光平均吸收程度、平均灰度等不同角度反映DNA降解后的含量变化,即通过对Feulgen染色[4,5]后细胞核DNA含量的定量分析表明:
人脑细胞核DNA降解后的残存含量规律性减少与PMI存在显著的相关性,DNA降解速率改变与PMI存在明显的对应关系。但由于
