一万年前猿类全身被毛，随着自然界长时间的进化，最终演变成了皮肤表面毛发稀疏且短的人类，而在人类进化的过程中，毛发并没有全部褪去，人的头发、眉毛、眼睫毛、汗毛等依然存在，毛发是怎样形成又选择性褪去的呢？现代社会，人类为了追求美根据个人的喜好，设计各种发型，但我们也常会注意到那些由于先天或后天因素导致头发稀疏或毛发过多的人，他们头发的生长又是怎样被调控的呢，这些问题亟需我们深入研究探讨。据有关报道，毛发的形成和脱落是一个极其复杂的生理过程，这个过程受到多种基因的调节，但外界因素如环境、饮食、营养等对毛发的生长发育也有一定的影响[6-10]。我们知道毛发的生长发育关键是某些基因的调控，但调控的分子机制我们现在仍然没有研究透彻，因此，对于毛发的研究我们应将重点放在分子机制的解析方面，找出影响毛发生成的关键因子是我们现阶段研究的目标，正确分析基因调控的分子机制，将为临床上治疗某些毛发疾病提供方法手段，研发新的有效治疗药物指明方向。
1.1 毛发和毛囊的结构
毛发是身体上的一种特殊组织，它是由表皮角质衍变形成的，从形态学观察毛发，裸露在皮肤表面的部分是发干，位于皮肤内完全被毛囊包裹的那部分是发根；从组织结构来看，毛发是由毛和毛囊组成的，毛囊是存在于皮肤内高敏感的微型器官，由上皮和真皮两部分组成，是调节毛发周期性生长发育的重要结构，毛囊的发育及周期性变化主要是毛囊细胞和真皮乳头间充质细胞的相互影响产生的。在毛囊发育初期，表皮管状内陷至真皮后再由周围的结缔组织包被就形成了毛囊，毛囊的上皮组织诱使真皮形成毛乳头前体，毛乳头前体结构刺激上皮组织形成毛胚芽，随后毛胚芽分泌一些物质诱导形成毛乳头，最后毛乳头诱导上皮组织细胞增殖分化形成真正意义上的毛囊[11, 12]。毛发的生长是一个依靠毛囊干细胞周期性分化形成而有序循环发生的生理过程，生长周期包括三个时相，分别为生长期、退行期、休止期（图 1.1）。毛发的周期性生长要求毛囊干细胞不断增殖分化保持稳态平衡，新生毛发的生长需要相邻间充质细胞的信号刺激毛囊外根鞘特化部分的多能干细胞进入生长期，从而指导上皮干细胞迁移分化再生成毛球，随即形成新的毛发结构[13]。
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1.2 毛囊生长发育过程的调控机制
毛囊的生长发育受控于一些信号通路的影响，依赖于一些信号分子的调节作用，这些信号分子游离在上皮和真皮细胞之间，介导这两种细胞相互作用，毛囊干细胞有序地增生、分化，最后形成毛囊结构控制毛发的生长。
1.2.1 Wnt 信号通路对毛囊的调控
Wnt（Wingless-related)蛋白通过与细胞膜上的卷曲受体蛋白家族共同作用将细胞信号传递到胞内，引起细胞内 β-连环蛋白（β-catenin）的堆积并且转到细胞核内，这些转到核内的 β-catenin 作为转录辅助因子与 TCF/LEF 家族作用从而调控下游基因的转录和表达。Wnt 信号通路中的作用元件 β-catenin 可以启动毛囊开始形成也可以使其融合，对于毛囊的形态发生的起始具有重要的指导作用。在小鼠皮肤组织中 β-catenin 的高表达可促使在已形成的毛囊间再次形成新的毛囊，但是如果 β-catenin 基因表达较低或不表达就会造成毛囊形成过程的异常，导致毛囊形成数量减少，从而影响毛发的生长[15]。Wnt 信号通路对毛囊调控的分子机制的探讨可以从毛发角蛋白开始，角蛋白基因的转录区含有一个可以与 TCF/LEF 蛋白家族特异结合的 DNA 序列，LEF 是一种 T 淋巴细胞分化的转录因子，可以与特异 DNA 序列结合，同时与 β-catenin 组合在一起形成顺式作用元件，行使特定的功能[16]。在毛囊细胞中也发现了 LEF-1 蛋白的表达，利用转基因技术使得毛囊细胞LEF-1 的表达过高，发现皮肤组织表皮内陷，与毛囊形成过程相似；研究 Lef-1基因敲除小鼠发现，小鼠的初级毛囊基板形成正常，但是毛囊的正常发育却受到阻碍[17, 18]。然而，并不是所有的 Wnt 基因都会对毛囊的形成发育产生影响，有报道称，Wnt4 突变造成小鼠的皮肤表型不正常，但若将这种突变鼠的皮肤移植到裸鼠身上，裸鼠的毛发却恢复正常，Wnt4 基因的表达可能调控裸鼠的皮肤形态的某种机制使其正常表现[19]。
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2 Hr 基因敲除小鼠的构建与繁育
2.1 材料与仪器
2.1.1 实验材料
大肠杆菌菌种、感受态细胞、TALEN 表达载体均由广州赛业生物科技有限公司提供和构建；实验动物是 C57BL/6J 小鼠，采购于北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK(粤）2013-0032），饲养在河南省（郑州大学）实验动物中心的动物房中，许可证号：SYXK(豫）2016-0002，小鼠饲料在河南省（郑州大学）实验动物中心购买，饲料经过60Co 辐射灭菌，饮水经过高温消毒灭菌，采用自由吃食，自由饮水的小鼠喂养方式。PCR 扩增引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成0.5 mol/L EDTA 溶液（pH8.0)：称量 14.6 g 的乙二胺四乙酸，加入 80 ml蒸馏水，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，再用氢氧化钠调节溶液的 pH 值至 8.0（约2 g NaOH),最后再加蒸馏水定容至 100 ml，经高压灭菌后室温保存。电泳缓冲液（50×TAE): 10 ml 0.5mol/L 的 EDTA 溶液，加入 24.2 g Tris碱,再加入 5.71 ml 的冰乙酸，再加蒸馏水定容至 100ml。10 mg/ml 溴化乙锭（EB)：称量 0.1 g 溴化乙锭倒入 10 ml 蒸馏水中搅拌均匀，最后将溶液转移至棕色瓶中，避光保存，由于溴化乙锭为剧烈的致癌物，操作时一定要做好安全防护，避免身体接触。
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2.2 实验方法
2.2.1 Hr 基因敲除 TALEN 载体的在线设计与选择
利用 TALEN 技术敲除基因值得注意的是 TALEN 的结构域 FokI 只有形成二聚体时才能发挥核酸酶活性，所以我们应该设计两个 TALEN 结合位点，才能发挥切割作用。完整的 TALEN 敲除靶点包括一个左臂 TALEN 结合位点和 0位 T 碱基、一个右臂 TALEN 结合位点和 0 位 T 碱基、中间是间隔序列。☆通常查找敲除靶点时，搜索结果会出现许多靶点，我们挑选敲除靶点的依据是：1）设计敲除靶点前我们应首先了解靶基因的生物学信息，如靶基因表达有几种 mRNA 剪接体，彼此之间有无联系，要破坏一种剪接体还是全部剪接体；2）挑选 TALEN 敲除靶点时 5'端开始应是碱基 T，有助于特异性识别基因序列；3）间隔序列长度一般为 14-21 bp，太短会影响特异性，太长增加合成费用；4）TALEN 靶位点序列应在靶基因的外显子中，最好在基因编码区前面的2/3 较好，且在起始密码子之后；5）靶点也可以在外显子与内含子之间，破坏靶基因的剪接；6）选择的靶基因序列在 NCBI 的 BLAST 验证序列的特异性；
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3 Hr 基因敲除小鼠的形态学和组织学观察..... 34
3.1 材料与仪器 .........34
3.1.1 实验动物 .........34
3.1.2 主要实验试剂配制方法........34
3.1.3 主要实验仪器 ............34
3.2 实验方法 .............35
3.2.1 每天观察记录 Hr 基因敲除小鼠的毛发形态 ......35
3.2.2 Hr 基因敲除小鼠的皮肤组织学切片 ........35
3.3 实验结果 .............36
3.3.1 Hr 基因敲除小鼠的形态学观察 .....36
3.3.2 Hr 基因敲除小鼠皮肤组织学观察结果 ....38
3.4 讨论 ..........40
4 检测敲除小鼠皮肤组织中 Hr 的表达部位和水平 ............. 42
4.1 材料与仪器 .........42
4.1.1 实验动物 .........42
4.1.2 主要实验试剂及配制............42
4.1.3 主要实验耗材及仪器............43
4.2 实验方法 .............44
4.2.1 免疫组化 .........44
4.2.2 实时荧光定量 PCR....46
4.2.3 蛋白印迹法（western blot）...........48
4.3 实验结果 .............51
4.4 讨论 ..........56
5 全文小结 .............. 58
4.4 讨论
HR 是一个核受体辅阻遏物，它能够调节某些相关基因的表达，从分子生物学方面研究 Hr 突变鼠的表皮成分，发现 HR 的表达抑制表皮分化相关基因的转录，异常调节表皮结构形成机制，导致毛发表型特异[69]。人类或小鼠的 Hr基因功能异常引发一种复杂的皮肤表型[70]，Hr 突变鼠出生后毛囊结构及初始毛发形成正常，毛囊处于退行期时毛发开始脱落，休止期的毛发不能顺利进入新一轮毛发的生长期，导致脱发症状，退行期毛发不能重新形成主要是由于毛乳头膨胀分离[71]。毛囊结构是由结缔组织和上皮组织两部分组成的，除了真皮乳头外，毛囊的其余组成部分都是由表皮干细胞分化而来的，毛囊生长期的缺失将引起一系列相关表皮干细胞群不能稳定形成，毛囊周期形成受影响，即毛发周期异常。HR 可能调节毛囊形成过程中相关基因的表达，但是 HR 在毛囊结构形成中的作用还不清楚。近年来的研究发现 HR 抑制 Wnt 信号通路的一个抑制因子 Wise 基因的表达，Wnt 信号通路是调控毛囊周期的一个重要信号通路，HR 不同时期的表达变化可能影响 Wnt 信号的正常出现时
