第一部分 血根碱对人肝细胞色素 P450 酶的抑制研究
（一）前 言
细胞色素 P450 (cytochrome P450，CYP)是人体内最紧张的药物代谢酶，约莫60％的药物的紧张打扫是由 CYP 介导的[1]，因此，CYP 是决定药物代谢稳固性的关键因素。CYP 酶分子量约莫为 50kDa，属于含铁血红素的蛋白超眷属，肝脏是其散布的紧张靶器官。CYP 加入了人体胆固醇、激素、脂肪酸、维生素等多种内源性物质的合成和代谢，对维持人体正常生理成果起到了紧张的作用[1]。它也加入了多数外来物的解毒和药物的代谢，在人的 57 个 CYP 酶亚型中，加入外来物包括药物代谢的紧张为 CYP1、CYP2 和 CYP3 眷属[2]。加入外来物代谢的 CYP 中，最紧张的为 CYP1A2、CYP2A6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和 CYP3A4。它们在肝脏中相对含量分别为[3-5]：CYP1A2 (8%)、CYP2A6 (12%)、CYP2C8 (12%)、CYP2C9 (18%)、CYP2C19 (4%)、CYP2D6 (2%)、CYP2E1 (9%)和 CYP3A4 (20%)。它们加入代谢药物的比例[3-5]分别为：CYP1A2 (7%)、CYP2A6(3%)、CYP2C8 (5%)、CYP2C9 (9%)、CYP2C19 (6%)、CYP2D6 (21%)、CYP2E1 (1%)和 CYP3A4 (48%)。CYP 酶介导的代谢回声是多数药物体内消除的限速步骤，该回声快慢决定着药物在体内平静性、有效性以及毒性的发挥[6]。鉴于此，药物研发机构向来高度珍视由 CYP 酶介导的药物代谢通路，测定目标的候选药物(drugcandidates)是否为 CYP 酶的底物、克制剂及诱导剂已成为药物发明和开发中的一项老例检查项目。检测结果在下一阶段的候选药物选择、认定、优化中发挥关键作用。
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（二）材料和方法
1.试剂
血根碱(纯度≥98%)购自中国药品生物制品检定所。D-葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、皮质酮、NADP+、非那西丁、对乙酰氨基酚、7-羟香豆素、4'-羟双氯芬酸、磺胺苯吡唑、反苯环丙胺、右啡烷、奎尼丁、氯美噻唑、氯唑沙宗、6-羟氯唑沙宗、紫杉醇、6β-羟睾酮和呋拉茶碱购自美国 Sigma-Aldrich 公司。睾酮购自比利时 Acros Organics 公司。香豆素、双氯芬酸、右美沙芬和酮康唑购自美国 ICNBiomedicals。混合人肝微粒体(29 例供体) 购自美国 BD 公司，分别具有 CYP1A2介导的非那西丁去乙基活性(650pmol/min/mg)， CYP2A6 介导的香豆素 7 羟化活性(1 nmol/min/mg)，CYP2E1介导的氯唑沙宗6羟化活性 (3 nmol/min/mg), CYP2D6介导的丁呋洛尔10羟化活性(84 pmol/min/mg), CYP2C8 介导的紫杉醇6α羟化活性(210 pmol/min/mg)，CYP2C9 介导的双氯芬酸 4'-羟化活性(2.5 nmol/min/mg) 及CYP3A 介导的睾酮 6β羟化活性 (4 nmol/min/mg) 。 其它的试剂都是 HPLC 级或可购买到的最高级别。
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第二部分 血根碱对人恶性黑素瘤 451LU 细胞粘附侵袭、转移能力的影响
（一）前言
恶性黑素瘤是一种高度恶性的肿瘤，多产生于皮肤，占皮肤恶性肿瘤的第三位（6.8%-20%）[1]。恶性黑素瘤因其连续增长的发病率和去世亡率而引起了越来越多的器重。现在，恶性黑素瘤占全部肿瘤的 3%，其发病率均匀增长速率为每年4%-6%[2]。在美国，恶性黑素瘤发病率的增长速率仅次于肺癌。据预计，每年新增的恶性黑素瘤患者凌驾 41000 例。在因患癌症去世亡的病例中，恶性黑素瘤约占1%[3]。恶性黑素瘤作为恶性水平最高的皮肤肿瘤，通常较早产生转移且对传统化疗不敏感，因此预后较差[4]。有报道称，一旦手术不克不及治愈，恶性黑素瘤的 5 年中期生存率仅为 6 个月，5 年生存率低于 5%[5]。恶性黑素瘤皮损形态多种多样，且每每不被人们所器重，每每延误了诊治，很多恶性玄色素瘤患者在肿瘤确诊时已生长到中晚期，此时多数已出现远处转移征象，错过了最佳的治疗时期。肿瘤细胞对基底膜的侵袭本领、肿瘤-基质的粘附本领及复活血管的天生是肿瘤转移的三大概害步调[6]。因此，针对其转移机制的治疗要领已经成为新药开辟的新的研究热门。
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（二）材料与方法
1．材料
1. 1 主要试剂
血根碱(纯度≥98%)购自中国药品生物制品检定所, 用二甲基亚砜DMSO配置成20mM的储存液，滤器滤过灭菌后保存于-20℃，四甲基偶氮唑蓝（MTT）、磺基罗丹明B（SRB）、DMSO、碘化丙啶（PI）购自美国sigma公司、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，western及IP细胞裂解液、Matrigel、PMSF购自美国BD公司， Annexin．V．FITC凋亡测试剂盒购自Biosoure公司，基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、局部粘着斑激酶（FAK）、磷酸化-局部粘着斑激酶（P-FAK），肌动蛋白（β-actin）抗体购自美国Abcam公司。
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第三部分 451LU 细胞三维培养模型的构建及评价................. 64-83
（一）前言..................................... 64
（二）材料和方法.................... 64-69
1. 主要试剂及仪器......................... 64-65
1.1 主要试剂.................. 64
1.2 主要仪器设备..................... 64-65
1.3 细胞系........................... 65
2. 实验方法............. 65-69
2.1 451LU 细胞复苏.................... 65
2.2 451LU 细胞传代.............. 65-66
2.3 鼠尾胶原的制备............. 66
2.4 451LU 细胞三维模型的构建..................... 66
2.5 细胞形态学观察 ...............................66
2.6 激光共聚焦显微镜观察.................. 66
2.7 生长曲线测定........................ 66-68
2.7.1 总 DNA 的提取................. 66-67
2.7.2 DNA 定量 .............................67-68
2.8 总 RNA 的抽提 ......................68
2.9 PCR 技术体外扩增 DNA .................68
2.10 相关基因 mRNA 的检测 ..................68-69
2.11 统计学分析................................... 69
（三）结果 ..............69-74
1.二维与三维培养条件，451LU 细胞形态的变化............ 69-70
2.二维与三维培养条件，451LU 细胞生长曲线的变化.............. 70
3.共聚焦显微镜观察三维培养条件下 451LU 细胞细胞活力的变化................... 70-71
4.阿霉素、长春碱、紫杉醇、血根碱对二维与三维培养条件下 451LU细胞细胞活力的影响....... 71-73
5.二维与三维培养条件下， 451LU 细胞相关基因的表达差异 ..............73-74
（四）讨论
传统的抗癌药物筛选模子，即通常所说的二维造就模子，在这种造就条件下，细胞处于平面生长的模式，由于缺乏细胞外基质的支持，肿瘤细胞贴壁生长而失去了一些生物学活性，一定会与在体内状态下的特性存在较大的差别，且由于缺乏三维立体布局，在研究细胞与细胞之间，细胞与微情况之间的干系时具有肯定的范围性。现在重要的体外三维造就要领重要包罗以下几种要领：①细胞自觉聚团，形成由单一细胞或多种细胞构成的细胞团。但此法仅范围于个体范例的细胞，且细胞联合疏松，聚团巨细可控制性差[11]。②接纳模仿微重力的旋转式反响器制备细胞聚团，该造就体系中流体剪切力低，造就情况可控，但必要特别设置装备部署，反响器操纵庞大，制备范围有限[12]。③基于支架的细胞造就，或接纳自然的某人工合成的质料制备三维支架，接种细胞后举行造就，以模仿细胞在体内生存的微情况，但制备和造就繁琐[13]。本部门研究重要拟创建一种较为底子的三维造就模子，即将 451LU 细胞莳植于鼠尾
