土木香内酯对慢性粒细胞白血病耐药K562-ADR的作用及机制研讨

前 言

影响白血病治疗疗效的另外一个重要原因是耐药性的产生，多药耐药性(Multipledrug Resistance，MDR)指的是对于一种药物具有耐药性的同时，对其他结构不同，而且作用靶点不同的抗肿瘤药物也具有一定的耐药性，这也是导致肿瘤化疗失败的重要原因之一。MDR 的产生与多种机制有关。其中 mdr-1 基因及其编码产物 P-gp 糖蛋白在肿瘤细胞表面的过度表达被认为是介导MDR最经典的机制，也是白血病多药耐药性的最主要形成机制。P-gp糖蛋白能够嵌插于细胞的浆膜上，具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能，能够将细胞内底物包括多种抗肿瘤药物泵出胞外，使细胞内药物积聚浓度下降而产生耐药。除此之外，有研究显示，P-gp 还可以通过抑制依赖 caspase 途径的细胞凋亡作用而产生耐药[11]。因而通过下调肿瘤细胞 P-gp 的表达也能够重新激活依赖 caspase 途径的细胞凋亡作用，促进肿瘤细胞凋亡。鉴于白血病治疗上的难度，从传统中药中筛选具有抗白血病作用的有效单体成分，并探讨其活性成分的治疗机制，这可能成为白血病治疗的新途径，找到治疗白血病新的突破点。土木香(Inula helenium L.)属于菊科旋覆花属植物，为多年生草本植物，在我国多分布于新疆等地区，其他许多地区也常有栽培；其干燥根可供药用，具有健胃养胃、祛痰、驱虫和利尿等多种功效[12]。土木香内酯是从土木香的根中分离出的主要倍半萜内酯化合物之一，而且已证实其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种作用[13-16]。有研究显示，土木香内酯能够通过增加活性氧族(Reactiveoxygen species，ROS)的产生通过线粒体损伤诱导神经胶质瘤细胞 U87 的凋亡[17]。Lei JC 等[18]的研究显示土木香内酯同样也能够诱导肝癌细胞凋亡，其主要机制是通过调节 Bcl-2 家族蛋白的表达及 caspase 的激活来实现的。此外有报道显示从土木香根中提取出的组分混合物(含土木香内酯和异土木香内酯)作用于白血病细胞HL-60，能够明显的抑制细胞的生长，并诱导其凋亡[19]。由此，我们设想是否土木香内酯也能够有效的抑制 bcr/Abl 融合基因高表达的慢性粒细胞白血病细胞株K562 及其耐药细胞株 K562/ADR 的生长。由此我们展开研究，并探讨其可能的机制。这构成了本实验的基本内容和主要目标。

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材料与方法

一、材料

（一）主要试剂及试剂盒

RPMI-1640 培养基                  美国 Sigma 公司

胎牛血清                               美国 Sigma 公司

台盼蓝                                  美国 Sigma 公司

MTT                                     美国 Sigma 公司

Rhodamine 123                      美国 Sigma 公司

DAPI                                     美国 Sigma 公司

碘化丙啶染色液( PI)                 美国 Sigma 公司

RNase A                                  美国 Sigma 公司

二甲基亚砜(DMSO)                   美国 Sigma 公司

Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒       碧云天

阿霉素                                      美国 Sigma 公司

土木香内酯                                 中国药品生物制品检定所

TBST、SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、过硫酸铵、氯化钠等化学药品均购至上海生工。

（二）细胞株及培养试剂配制
1. K562 白血病细胞株本实验室保存；K562/ADR 白血病耐药细胞株购置于中科院血液病研究所天津血液病医院。
2. 细胞培养基：按产品说明取两小瓶 RPMI-1640 干粉溶于 2000ml 超纯去离子水中，充分溶解后加入 2g 的 NaHCO3，11.9g 的 Hepes，使其充分溶解并用 0.22μm滤器滤过除菌，分装，4℃保存。
3. 磷酸盐缓冲溶液(PBS)：分别称取 Nacl 8.0g，Na2HPO41.44g，Kcl 0.2g，KH2PO40.24g，溶于 800ml 去离子水中，用 1M NaOH 调 pH 值至 7.2~7.4，加水至1000ml，室温保存。

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二、主要实验仪器

凝胶成像分析仪        美国 Alphal InnotechPCR 

扩增仪                    中国 北京东胜创新生物科技有限公司

水平摇床                 中国 北京六一

脱色摇床                 中国 北京六一

酸度计                    中国 北京赛多利斯仪器系统有限公司

垂直电泳仪              中国 上海天能

转移电泳槽              中国 上海天能

离心机                    美国 Thermo Fisher Scientific

恒温水浴锅              中国 上海精宏实验设备有限公司

恒温培养箱              中国 上海精宏实验设备有限公司

流式细胞分析仪        美国 BECKMAN COULTER EPICS XL

酶标仪                    美国 Thermo scietific

二氧化碳培养箱        美国 Thermo scietific

超净台                    中国 AIRTECH

荧光显微镜              日本 OLYMPUS 倒置 IX-71 CCD 镜头-DP72

低速离心机              美国 Thermo scietific

纯水机               &n