肝纤维化是指以胶原为主的细胞外基质过度合成或降解减少，形成肝脏结缔组织过度沉积的成纤维化，是慢性肝病重要的病理特征[1]，也是慢性肝炎、肝硬化发展、恶化的重要环节[2]。现肝病发生率平均累及世界总人口的 10%-24%，在我国高达 15.35%[3]，且由肝病发展为肝硬化是一个持续的病理变化过程，肝纤维化则是病变过程中的必由之路，其中肝病患者的25%-40%最终会发展为肝硬化甚至肝癌而死亡[4]。因而肝纤维化现已成为一个全世界发病率及死亡率都很高的医学难题，如何阻止甚至逆转肝纤维化的病变已成为肝脏疾病治疗过程中急需解决的首要问题。本研究属于中医学的研究范畴，而肝纤维化属于现代医学的概念，因此需要以中医理论为指导、临床功效为背景，在传统中医学领域找寻并优化动物模型，使得模型更符合中医证候理论、适宜于中医证候研究和中药药效评价。肝纤维化的病理变化在中医学范畴属于“积证”、“臌胀”、“胁痛”等，常见于中医的“痞积”、“黄疸”、 “积聚”、“胁痛”、 “肝着”、“肝积”等[5]。其病机演变是一个动态变化的进程，即是“由表及里、由实而虚、由气入血及络、由聚至积、由轻到重”的病变过程。由于肝与脾胃在生理病理上关系十分密切，肝主疏泄，脾主运化，病理状态下相互影响，互为因果。若肝气郁结、疏泄失司则导致脾胃功能紊乱，产生肝木克脾土的现象；而脾胃正气不足，血液生化乏源，同样会引起肝血不足、气机郁结、疏泄失司。据《金匮要略》记载：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾。”因此肝阴虚是发生肝纤维化的主要病机，而阴血亏虚为其病态反应；肝郁及脾，脾虚及肝，血瘀气滞为此病重要病机；肝脏正气不足、疏泄职能失常、气机运行不畅为是肝纤维化发生和发展的中医理论基础[6]。因此，肝郁脾虚是其主要病机，肝郁脾虚证是肝纤维化的主要证候。
柴胡，伞形科（Umbelliferae），以根入药，按性状不同分北柴胡（BulperumChineseDC.）和南柴胡（B.Scorzonerifolium Wild）。柴胡始载于清代，《本经》中列为上品[7]，其味苦、辛，性微寒，归肝胆经，具解表退热，疏肝解郁，升举清气之功；药理活性明显，临床应用广泛，前期临床研究发现柴胡具有较好的抗肝纤维化作用[8]，其单独水煎剂就具有抗肝纤维化作用。其中柴胡皂苷（Saikosaponins）是柴胡中主要化学指标及生物活性成份，其药理活性作用最强、毒性作用最为显著，根据其化学结构的差异性可分为柴胡皂苷 a、b、c 和 d 等[9]。前期研究发现，柴胡皂苷具有预防和治疗实验大鼠肝纤维化的作用，作用机制主要与调节血清中 TNF 炎症相关因子含量和组织型纤溶酶原激活因子（TPA）、纤溶酶原活化物抑制因子（PAI）、MDA 及对肝内脂质过氧化反应和血清中微量元素锌、钙水平有关[10]。柴胡虽列上品，但在临床实际应用过程中，逐渐发现柴胡具有一定的毒副作用。张景岳在《本草正》论述中称“柴胡之性，善泄善散，所以大能走汗，大能泄气，断非滋补之药……营即阴也，阴既虚矣，尚堪再损其阴否？”清代叶天士在《幼科要略》中提到“柴胡劫肝阴”，为后世所重视。《本草经疏》提出“病人虚而气升者忌之，呕吐及阴虚火炽炎上者，法所同忌”；《医学入门》中告诫“元气下决，阴火多汗者，误服必死”；《重庆堂随笔》谓“柴胡为正伤寒要药……不可以概治阴虚阳越之体，用者审之”。后又以“日本小柴胡事件”[11-13]为代表的肝损害 ADR 报道和毒理学研究证实，柴胡总皂苷是其肝毒性的主要物质基础。以中医药理论为指导，充分运用体内、体外多种实验手段开展多学科交叉研究，利用现代研究方法，研究有毒中药功效表达的同时，观察药物的毒性、不良反应、可能的毒性反应内在机制，科学地阐释有毒中药，科学合理地控制毒性，对于正确指导临床应用具有重大的现实意义。中医药治疗肝纤维化具有多途径、多环节、多层次、多靶点的综合效果，为了更好地研究肝郁脾虚型肝纤维化的本质，本研究将探讨柴胡如何发挥抗肝郁脾虚型肝纤维化药效？发挥药效的同时其毒副作用表达的特点及两者之间有何种关联？如何在最大程度上保证其疗效的同时将毒副作用降至最低？通过体内、外研究，柴胡对肝郁脾虚型肝纤维化的“效-毒”关联评价有何现实意义？故本研究在前期基础上对柴胡的抗肝郁脾虚型纤维化的作用及其作用机制进行初步探讨，并观察发挥药效剂量下出现的毒副作用，为初步阐明其“功效-毒性”相关性、保证临床安全有效用药提供实验依据。
..........
第一部分 与肝郁脾虚型肝纤维化和柴胡相关文献的挖掘与整理
1 肝郁脾虚型肝纤维化研究进展
.1 中医对肝郁脾虚型肝纤维化的认识
肝纤维化是现代医学病理形态学概念[14]，而在中医学范畴属于“积证”、“臌胀”、“胁痛”等，常见于中医的“黄疸”、“痞积”、 “胁痛”、 “肝着”、“积聚”、 “肝积”等[15]。当肝脏结缔组织过度沉积即成肝纤维化，中医中多认为因肝胆疏泄失职、气机不畅，导致肝脏郁结；又因肝病传脾，久则脾气内虚，邪毒阻滞肝络，气滞血瘀，肝脾不和。木郁克土，肝气横逆犯脾，使机体处于肝郁脾虚，虚实夹杂之中。病久失治，正气渐伤，不通则痛，从而出现胁痛；肝失条达，肝气郁结，气滞则血瘀，则成积聚痞块。诚如《灵枢.决气》所说：“中焦受气取汁，变化而赤，是谓血。”脾不健运，气血生化乏源而致血虚；脾虚失健而不能统血，亦可致血失而渐至营血亏虚。肝藏血，脾统血，又因脾为气血生化之源，脾运健旺，则生血有源，而且血不逸出脉外，导致肝有所藏；若脾虚则气血生化无源，又或脾不统血，二者均可导致肝血不足，导致肝疏泄功能减退而致肝气郁滞。《灵枢·百病始生篇》认为，病邪侵袭人体，或饮食起居不节等原因，导致“湿气不行，凝血蕴里而不散，津液涩渗，著而不去，而积皆成矣”。其病机演变是一个动态变化的进程，即是“由表及里、由实而虚、由气入血及络、由聚至积、由轻到重”的病变过程[6]。因此，“凝血蕴里”、“津液涩渗”，是形成肝纤维化的总病机，即以脾气虚损为本，以肝郁气滞为标，虚实错杂，其最基本的临床证候为肝郁脾虚。
.........
1.2 现代医学对肝郁脾虚型肝纤维化的临床认知
肝纤维化是指肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程，现代医学已对其发病机理研究较为明朗，主要是因为肝内肝星状细胞（Hepaticstellate cell，HSC）被大量激活、增殖、合成并分泌大量细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），且 ECM 降解减少、沉积增多。其中 ECM 主要成分为胶原，当胶原的合成、沉积与降解、吸收失去动态平衡时，即形成肝纤维化。肝郁脾虚型肝纤维化发生的整个过程中涉及多个不同水平的调节，是一个极其复杂的病理过程，其主要的病理特征表现为汇管区大量纤维组织的增生[16]。因此，现代医学对于肝郁脾虚型肝纤维化的治疗，是针对不同水平的调节因素，在纤维组织生成及其降解的过程中，从不同环节对肝脏纤维组织形成抑制作用，宜或促进讲解。
............
第三部分柴胡对肝郁脾虚型肝纤维化大鼠的抗纤维化作用研究 ......23
1 实验材料...........23
1.1 受试药物.........23
1.2 受试动物.........24
1.3 仪器与试剂.......24
2 实验方法...........24
2.1 动物分组.........24
2.2 饲料、药物的配制...........25
2.3 统计学方法.......25
3 实验结果...........25
3.1 大鼠一般状况观察...........25
3.2 中医证候积分变化情况.......26
3.3 脏器系数及血生化指标变化情况.........28
4 小结.....31
第四部分柴胡对肝郁脾虚型肝纤维化大鼠的药效伴随毒副作用研究 ............33
1 实验材料...........33
1.1 受试药物.........33
1.2 受试动物.........34
1.3 仪器与试剂.......342 实验方法...........35
3 实验结果...........35
3.1 日食量及日水量的变化.......35
3.2 血清生化指标的变化.........37
3.3 肝脏病理组织学检查.........38
4 小结.....39
第五部分柴胡体外抗肝纤维化及安全性研究 ............41
1 柴胡对肝星状 HSC-T6 细胞的影响..........41
2 柴胡对人肝 L-02 细胞的影响....46
2.1 实验材料.........46
2.2 实验方法.........46
2.3 实验结果.........47
3 小结.....50
第五部分 柴胡体外抗肝纤维化及安全性研究
本实验室前期研究[57]发现柴胡水煎剂大剂量、长时间使用会造成大鼠显著性肝脏损伤，为进一步探寻柴胡导致肝毒性的毒性物质基础，实验室进行了不同组分之间的大鼠肝毒性比较研究，研究发现柴胡的不同组分均可引起大鼠的肝损伤，其损伤途径与脂质过氧化和抑制氧自由基的排出有关[58]，其中柴胡总皂苷是柴胡产生药效和毒性的物质基础。中药存在着药效和毒性的双重属性，柴胡毒性在临床使用中逐步被人们熟知，因而柴胡药效研究应在毒理学和药理学的科学手段下进行探究。前部分实验在体内、整体的水平上开展了柴胡水提物和柴胡总皂苷在发挥抗肝纤维化药效和伴随毒副作用研究，证实连续给予大鼠 0.90~3.60 g·kg-1剂量的柴胡水提物在发挥抗肝郁脾虚型肝纤维化药效作用的基础上伴随一定的肝脏、肾脏的毒副作用，尤其以肝脏毒副作用为主，其中柴胡水提物在剂量为3.60 g·kg-1发挥药效作用时伴随毒副作用出现；连续给予大鼠 7.04~13.9
