本文是一篇医学论文范文，本研究对F22进行质谱鉴定，从结果中筛选出FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP作为诊断抗原候选分子并对这三种分子进行了原核重组表达，SDS-PAGE鉴定三种重组表达蛋白分子的质量较好。从rFgSAP-2、rFgCatL2、rFgLAP三种重组诊断抗原中筛选出rF gSAP-2并与F22作为诊断抗原分别建立起牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法。
第一章 文献综述
1.1 片形吸虫病概述
1.1.1 片形吸虫的病原特性
片形吸虫（Fasciola spp.）属于吸虫纲，复殖目，片形科，片形属，主要分为肝片形吸虫（F. hepatica, Fh）和大片形吸虫（F. gigantica, Fg），也有肝片形吸虫和大片形吸虫的中间型被报道[1]。片形吸虫的生活史具有世代交替的特征，片形吸虫虫卵孵化后毛蚴逸出，进入中间宿主锥实螺体内，经过一系列无性繁殖阶段发育成尾蚴逸出，在水草上形成囊蚴，囊蚴被终末宿主吞食后，进入宿主消化道中, 在宿主胃肠消化液、胆盐以及氧化还原电位和温度改变等综合因素的影响下囊蚴在宿主小肠内脱囊，而后主动穿过肠壁, 进入腹腔, 从肝表面钻入肝实质, 并在其中移行约 6 周, 最后进入胆管中寄生, 约经4 周发育为成虫并开始产卵。自感染囊蚴到粪便中发现虫卵的最短时间约为 10 周～11周。成虫在牛体内一般可生存 3～5 年, 在绵羊体内寄生的时间最长可达 11 年[2, 3]。
1.1.2 片形吸虫病的流行状况及危害
片形吸虫病根据感染宿主的片形吸虫种类的不同可分为肝片形吸虫病和大片形吸虫病。肝片形吸虫病主要在温带地区流行，大片形吸虫病则主要在非洲中部、南亚次大陆、东南亚以及我国的云南省、海南省、台湾地区及两广地区等热带以及亚热带地区流行。目前已知有数十种包括人类在内的哺乳动物可以感染片形吸虫，其中包括牛、羊等重要的经济动物[4-6]。世界卫生组织预计，全球已有 240 万人感染了片形吸虫，约 1.8 亿人有感染的危险，葡萄牙和法国曾在 20 世纪后半叶报道了数千例人感染肝片形吸虫病例[7, 8]，欧洲的其它地区也出现了多次片形吸虫感染人的情况。伊朗、土耳其、日本、韩国、越南、老挝等亚洲国家都出现过人感染片形吸虫的报道[9-12]。在非洲，埃及人感染片形吸虫的情况较为严重，仅在尼罗河三角洲，就有 80 余万人感染了片形吸虫[13], 在东非、中南美洲也有片形吸虫感染人的报道[14-16]。除此之外，我国也有多次人感染片形吸虫的报道[17]。相较于感染人，片形吸虫感染牛、羊等反刍兽在生产生活中更为常见。
1.2 片形吸虫病的诊断
片形吸虫病的诊断方法有虫卵检查、肝脏剖检、临床诊断、分子生物学诊断、免疫学诊断等。虫卵检查以及肝脏剖检统称为病原学检查。病原学检查的优点在于检查的准确性高，检测方法简单且不需要专门仪器设备，一旦在粪便中检出虫卵或剖检后在肝脏或胆囊中发现虫体，即可确诊。病原学诊断是片形吸虫病诊断的金标准。但其缺点在于虫卵的产生至少要在感染后 3~4 个月甚至更长的时间，不能用于早期诊断，可能会因此耽误治疗的最佳时机。肝脏剖检必须要将动物处死，无法应用于生产实践，由于少量片形吸虫感染后临床症状不明显且不典型，因此临床诊断也不适用于片形吸虫病的诊断。分子生物学诊断法运用较少，虽然也偶见利用分子生物学手段诊断片形吸虫病[24]，但分子生物学方法经常用于片形吸虫的虫种分型与鉴定[25]。免疫学诊断是片形吸虫病诊断中最常见的并且具有最佳的诊断效果。
对流免疫电泳（CIEP）是利用免疫球蛋白在电泳时向阴极靠近的现象设计的一种检测方法。具体方法是将抗原置于阴极，待测血清置于阳极后进行电泳，当抗原抗体相遇并出现沉淀线时即为阳性。此方法特异性强，能够进行早期诊断。但由于操作较困难，因此应用的场景有限。
间接血凝试验（IHA）的原理是将抗原包被于红细胞表面，当存在此种抗原的抗体时，抗原和抗体会发生特异性结合，从而使红细胞聚集成为肉眼可见的团块，从而判定样品中有无特异性抗体存在，间接血凝试验操作较为简单、相关试剂耗材价格较低、敏感性也较好，但特异性较差，在上世纪应用较多，但近些年应用较少[27]。
第二章 大片形吸虫诊断抗原的制备
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂耗材
诊断抗原的制备是建立免疫学诊断方法的关键。本实验室前期通过对 FgESP 进行分子筛层析获得了 F22 并初步证实其是较好的大片形吸虫诊断抗原[43]，本章参照先前的方法重新制备 F22 并对其进行质谱，在质谱结果中筛选出 3 个在肝片形吸虫病或其它寄生虫病诊断中有较好诊断效果的蛋白分子进行原核表达，从而获得 F22 以及 3 个重组诊断抗原共 4 个大片形吸虫诊断抗原，为下一步免疫学诊断方法的建立做准备。
2.2 实验方法
2.2.1 F22 的制备
2.2.1.1 FgESP 的收集
（1）将采集自胆囊中的大片形吸虫虫体用毛笔轻轻挑入 37℃的 0.01 M PBS 中，反复冲洗 3~5 遍，再将洗干净的虫体置于培养皿中，加入 0.01 M PBS（2 条虫体/ml）37℃培养 3 h。
（2）吸出培养皿中液体，3000 rpm 离心 5 min，上清用 0.45 μm 滤器过滤，-80℃保存。
2.2.1.2 FgESP 的冻干浓缩
（1）将融化后 FgESP 每瓶 50 ml 装入冻干瓶中，置于-80℃过夜。
（2）打开冻干机，按说明设定程序，待温度降至-80℃以下，气压下降至 0.3 毫巴以下，将冻干瓶固定于冻干机上，冻干至 FgESP 全部变为粉末状。
（3）将冻干瓶取下置于冰上，用少量双蒸水将粉末溶解。
2.2.1.3 FgESP 浓度测定
（1）取少量浓缩后的 FgESP，用 PBS 稀释 20 倍。
（2）试剂盒中的 A 液与 B 液按 50:1 的比例充分混匀，即为 BCA 工作液。
（3）取 BSA 蛋白标准品（1 mg/mL），用 0.01 M PBS 分别按原液，1:2、1:4、1:8、1:16、1:32 进行稀释，每管 50 μl。
（4）取 25 μl 蛋白标准品和待测样品分别加入 96 孔板中。每个待测样品设置 3 个重复孔。
（5）加入 BCA 工作液 200 μl/孔，充分混匀，37℃显色 30 min。
（6）酶标仪测定 OD595nm。
（7）利用最小二乘法计算标准蛋白的回归方程（r2>0.95），计算样品中的蛋白浓度。
（8）根据所测定的浓度，将浓缩后的 FgESP 稀释至 10 mg/ml，-80℃保存。
第三章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立 ........................... 37
3.1 实验材料 ................................. 37
3.1.1 主要试剂 .............................. 37
3.1.2 主要耗材 .......................................... 37
第四章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的应用 ........................... 67
4.1 实验材料 ............................... 67
4.1.1 主要试剂 ................................ 67
4.1.2 主要仪器设备 ..................................... 67
第五章 全文总结 ................................... 77
第四章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的应用
4.2 实验方法
4.2.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查
4.2.1.1 实验步骤
（1）提前对样品已有的基本信息进行登记、按地区再整理排序、编号，并将样品编号与 96 孔板编号一一对应后清晰记录。抗原的包被需要在提前一天晚上进行，然后将96 孔板放置在 4℃过夜。提前配置足够的 PBS 缓冲液与 PBST 等主要试剂。
（2）抗原包被：利用 0.05M 的碳酸盐缓冲液（pH=9.6）将 FgESP 稀释为 2.5 μg/mL，F22 按优化好的浓度稀释，按照每孔 100 μl 的量加入 96 孔板中，前 6 列加入 FgESP，后 6 列加入 F22。37℃孵育 2.5 h，4℃过夜。
（3）封闭：用 PBST 洗板 4 次，每孔加入 200 μl，每次 5 min，5 min 后倒掉孔中PBST 并在吸水纸上拍干，加入 1 %明胶封闭液，每孔 150 μl，37℃恒温箱孵育 2 h。
（4）加待测血清样品：PBST 洗板 4 次，每孔加入 200 μl，每次 5 min，5 min 后倒掉孔中 PBST 并在吸水纸上拍干。取用 20 份待测血清、牛大片形吸虫标准阳性血清以及牛大片形吸虫标准阴性血清，分别使用 PBS 按 1:400 稀释，每个待测血清做两个重复孔，一块板可以检测 20 份待测血清，水牛大片形吸虫标准阳性血清与水牛大片形吸虫标准阴性血清分别设置三个重复孔，还
