本文是一篇医学论文范文，本研究中，我们用绿色、简单和快速的方法构建和配置了四种 LDH 纳米颗粒，他们在生理环境中表现出不同的胶体稳定性并且颗粒尺寸大小及所携带电势电荷各不相同，装载上相同质量的 OVA，制成基于 LDH 的分散性不同的纳米疫苗。将 LDH 疫苗与装载相同质量抗原的铝佐剂疫苗一同皮下注射至小鼠体内，探究疫苗刺激小鼠产生的体液免疫反应强度，通过上述所有实验结果证明，LDH 是一种良好的铝佐剂替代品，能够很好的解决铝佐剂无法刺激机体产生 Th1 型免疫反应的缺陷，并且对动物体产生的刺激较小，在体内能够很好的降解。结合以上结果，我们认为抗原与 LDH 质量比为 5：40 时，能够刺激机体产生较为理想的体液免疫保护屏障。
1 前言
1.1 兽用佐剂现状
20 世纪 70 年代以来，中国畜牧业发展取得了举世瞩目的成就，成为了农业经济增长中最具前景的增长点之一，在保持畜牧经济稳步增长的同时，维护动物健康，保证动物产品质量安全成为目前棘手问题之一。“预防为主，治疗为辅”是我国动物传染病防治的方向，对于我国防治动物传染病具有重要意义。我国畜牧业规模庞大，畜牧产值占农业总产值的 34%，是我国经济的重要组成部分，养殖动物种类多且杂，养殖方式不统一，既有规模化养殖又有大量的分散饲养，这种现状导致经济动物质量不稳定，难于管理，给控制动物传染病的传播带来巨大挑战，并且由于小规模散养，人与动物密切接触，给人兽共患病提供了发展空间，对人和牲畜的生命健康及财产安全带来隐形威胁。由于养殖数量巨大，养殖方式多样，全体扑杀或者个体治疗成本太大，国家和养殖主都难以承担，因此应用兽用疫苗接种来进行动物传染病的预防是控制动物传染病的重要方式之一。
疫苗是由一种或多种病原微生物通过灭活或减毒等多种方式处理所制成的生物制品，是通过诱导特异性免疫反应以保护身体免受疾病侵害的制剂，用来预防或治疗各类传染性疾病。疫苗一般由疾病特异性抗原(如已灭活或减毒的生物体、蛋白质或蛋白质亚单位、或编码病原体抗原蛋白的 DNA)和佐剂组成。这种抗原与致病微生物相似，但本身并不危险。在有效疫苗中，抗原被人体识别为“外来的”，并引起免疫反应。这使免疫系统学会识别病原体，更重要的是“记住”它，以便在随后的接触中，身体对病原体有足够的生物防御，并击败它，而不会导致任何疾病。传统上，抗原是病原体的一种形式，已被安全处理(“减毒”)或杀死(“灭活”)。然而，这些抗原不能被频繁使用，因为在减毒或灭活后总有一些活的和危险的病原体存在的风险。这意味着在预防恶性传染病或新出现传染病时，需要一种更安全的抗原。在这种情况下使用亚单位抗原(包括病原体的蛋白质成分)，这样就没有任何活病原体存在的风险，因此这种疫苗非常安全。随着人们对于动物产品质量要求的提高，传统疫苗已无法满足生产需求，亚单位疫苗、DNA 疫苗等安全性更高的新型疫苗被更多人重视，然而，亚单位疫苗等新型疫苗的免疫原性差，往往不能诱导有效的免疫反应，这是开发有效疫苗的一个重大挑战(Melief et al., 2008;Purcell et al., 2007)。为了诱导有效的保护性免疫，较差的免疫原性抗原，如亚单位抗原，需要用称为“佐剂”的药物增强。佐剂可分为两类:免疫调节分子佐剂和传递系统佐剂。
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1.2 水滑石(Layered Double Hydroxides, LDH )概述
LDH 是一种具有特殊的理化性质二维（2D）粘土纳米材料，在生物医疗领域多有应用(Y. Chen et al., 2018)。LDH 具有特殊的 2D 拓扑结构，因此其具有相当大的表面积，能够实现高载药量和超高的生物活性，从而成为有效的药物载体、活性催化剂和高性能生物成像造影剂(Y. Chen et al., 2018; Yang et al., 2013)。二维纳米材料如石墨烯、石墨碳硝酸盐、黑磷等具有极高的光热转换效率、优异的光动力学特性以及理想的生物成像效果，因此在药物应用以及免疫治疗中具有极大的应用前景(Y. Chen et al., 2015; Y. Chen etal., 2017; Gu, Atherton, et al., 2015; Lin et al., 2020; Tao et al., 2017)。特别是 LDH 由于具有极高的生物相容性且在体内易降解，近年来在生物医学领域具有广泛应用(W. Chen, M.Qin, et al., 2018; Mitter et al., 2017; J. Sun et al., 2017; Zuo et al., 2017)。
1.2.1 水滑石纳米佐剂
1.2.1.1 水滑石组成及结构
LDH 由带正电荷的八面体 M(OH)6 组成的阳离子层板以及含有阴离子和水分子的层间通道共同组成，通式为[M2+ 1-x M3+x(OH)2] x+An-x/n⋅mH2O。其中，M2+代表二价金属阳离子（如 Mg2+, Fe2+, Co2+, Cu2+, Ni2+, Zn2+），M3+代表三价金属阳离子（如 Al3+, Cr3+,Ga3+, In3+, Mn3+, Fe3+），An-代表层间可交换的客体阴离子（如 NO3 - , Cl- , SO4 2- , CO3 2- ）[25]。以 MgAl-LDH 为例，由 Mg2+和 Al3+组成的阳离子层板携带正电荷，客体阴离子如 Cl - 进入阳离子层板间维持电荷平衡。阳离子层板和层间阴离子通过静电相互作用和氢键结合在一起，从而形成了稳定的“三明治夹心”状的片层结构。
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2 材料与方法
2.1实验方法
2.1.1 水热法制备 LDH
本文使用水热合成法制备106nm左右的LDH (S. J. Choi et al., 2011; Xu, Stevenson,Lu, & Lu, 2006),首先称取 0.72g ALCL3·6H20,1.42g MgCl2·6H2O 溶于 10 ml 超纯水，0.72g NaO H 溶于 40 ml 超纯水中。将 NaO H 溶液置于 100 ml 圆底烧瓶中搅拌 20～30分钟，此过程全程通氮气，防止碳酸化。随后用 20 ml 注射器，将 10 ml 混合溶液在5 秒内快速注入圆底烧瓶中，全程通氮气，搅拌 10～15 分钟。将 50 ml 混合溶液分至两只 50 ml 离心管中，在 4250g，3min 条件下离心，弃去上清，加入 25 ml 超纯水重悬后以同样条件离心，此过程重复两次。最后一次清洗结束后，弃去上清，每只离心管用 20 ml 超纯水重悬，将 40 ml 重悬液倒入 100 ml 水热釜中，放入 100℃烘箱，加热 16 h。收取 LDH 浓度为 10 mg/ml。取少量 LDH 稀释至 10 ug/ml,取 10 ul 置于铜网上，在透射电镜下观察其结构，将 LDH 稀释至 4 mg/ml,冻干机中冻干，取冻干粉末做 XRD 及 FTIC 表征。
2.1.2不同分散性 LDH 的制备与表征
采用白蛋白包被法制备不同分散性 LDH(Gu, Zuo, et al., 2015; Zuo et al., 2015)，首先将鸡卵清蛋白（OVA）和牛血清蛋白（BSA）蛋白溶液放入烧瓶置于磁力搅拌器上，将等体积的 4 mg/ml LDH 溶液用 1 ml 注射器贴壁缓慢滴加到不同浓度的蛋白溶液（10mg/ml、2.5mg/ml、0.5mg/ml、0.125mg/ml）中，滴加后搅拌 2 分钟。合成不同分散态 LDH 纳米颗粒（BSA:LDH100:40、BSA:LDH25:40、BSA:LDH5:40 和 BSA:LDH1.25：40）。将纳米疫苗用分别用超纯水、1640 培养基+10 % FBS 稀释 5 倍，在 DLS 上测定其粒径和电荷。取各组不同分散性的 LDH 纳米疫苗放入-80℃冰箱中冷冻过夜，之后用冻干机冻成干粉，作 XRD 及 FTIC 检测使用，以此判断抗原蛋白质的加载情况。为了直观的看到纳米疫苗的结构形态，将纳米疫苗置于铜网，在生物透射电镜（TEM）下观察。
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2.2动物实验伦理说明
本实验所用小鼠，全部购买于维通利华实验动物中心，购买后饲养于 SPF 级无菌动物房。无菌动物房建设严格按照相关要求，附有自动节律系统，独立的通风系统，每 6只小鼠一笼，每只鼠笼有自动喂食器和无菌水喂养装置，由专业人员照顾，每周换两次垫料，饲养环境安静舒适。实验开始前，动物会在动物房放置一周使其熟悉适应环境。动物实验参与者已取得动物实验操作规范证书，可以熟练完成各项实验，保证将小鼠痛苦降到最低。
所有动物实验采取随机分配原则进行。文中数据均以 means ± s.e.m. 的形式展现，利用 GraphPad Prism 8 通过 one-way 变量分析法对多平行对照组的显著性进行分析。P值小于 0.05 即被认定为具有显著性差异。
.表 3 不同分散性疫苗成分
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3 结果与分析.................................25
3.1 纳米疫苗物理表征结果..................................25
3.2 疫苗分散性对细胞吞噬及胞内分布的影响..............27
3.3 体液免疫结果分析...............28
4 讨论...................33
5 结论..............
