本文是一篇农业论文，本研究选用绵羊瘤胃上皮细胞作为研究对象，以SARA产生的主要有害物质LPS为刺激物，建立瘤胃上皮细胞炎症损伤模型，探究芦丁对LPS诱导瘤胃上皮细胞炎症损伤的干预作用及其分子机制，为芦丁作为缓解高精料饲粮下反刍动物瘤胃上皮炎症等代谢性障碍疾病的饲用添加剂应用于反刍动物生产奠定理论基础。
1 引言
1.1 炎症反应的研究进展
炎症是宿主对不良刺激和条件作出的生物学反应，是抵御感染、组织修复和恢复内环境稳态的基础。炎症反应十分复杂，需要组织、细胞、基因和信号通路在多个水平上进行特异性调控。一旦机体受到刺激出现炎性变化，作为机体首要防御系统的天然免疫系统就会立即启动，包括免疫细胞受体对病毒和微生物携带特定分子的识别、炎症介质的分泌以及单核细胞和粒细胞向感染部位的迁移。此外，活化信号传导途径以及调节基因表达同样可以调节炎性反应。然而，如果这些复杂机制失调，炎症反应的有益作用可能会适得其反。
1.1.1 炎症反应的发生与发展
两千多年前人们就知道，由感染或伤口引起的炎症现象是机体的一种防御策略，是机体清除感染因子和修复感染组织的基本机制。炎症过程的目标是恢复良好的健康状态并回到内稳态。炎症是一个极其复杂的过程，目前认为是由于白细胞、肥大细胞和血小板的积累，释放各种类型的脂质介质（类二十烷类）、蛋白质（细胞因子、趋化因子）和气体介质（一氧化氮、一氧化碳、活性氧）等到达受损组织或者细胞后引发的免疫反应，趋化因子定向趋化免疫细胞到达受损组织部位；同时趋化因子可以刺激细胞因子分泌促进炎症反应，消除触发炎症的因素，从而恢复机体健康的状态。炎症触发因子主要包括微生物和病毒降解产物以及细胞因子等，其可以通过与Toll样受体（TLRs）、细胞因子受体之间相互作用介导炎症的发生，受体被激活后可调控由丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子kappa-B（NF-κB）和Janus激酶（JAK)-转录信号转换器和激活器（STAT）等控制的信号通路，通路启动后可以调控下游相关基因的转录或蛋白的翻译表达，例如白介素（IL）、干扰素（INF）、转化生长因子（TGF）和趋化因子等，通过级联放大反应加重炎症反应的症状。NF-κB、MAPK或JAK-STAT信号通路的失调是许多炎症、自身免疫和代谢疾病的一个重要病因[1]。炎症反应的特征是协调激活各种信号通路，从血液中招募驻留在组织细胞和白细胞中的促炎和抗炎介质。炎症反应发生通常被分为三个步骤，首先，神经元会释放生物活性肽使机体产生疼痛感；其次，破损的细胞会释放胞内蛋白，当在细胞外空间发现胞内蛋白时，会触发细胞因子的产生，胞内蛋白主要包括热休克蛋白、转录因子高迁移率组蛋白1和具有原核蛋白n-甲酰基特征的线粒体肽等；第三，微生物及其脱落或分泌的产物主要是通过其保守分子组分与可溶性受体（如补体、甘露糖结合蛋白和脂多糖结合蛋白）、细胞表面受体（如Toll家族成员、肽聚糖识别蛋白和清道夫受体）的结合诱发炎症反应[2][3][4]。当白细胞、巨噬细胞到达患处后，会协调细胞因子以及相关酶类加速受损部位愈合，但愈合结果会因为损伤缘由、程度等不同而有所不同。绝大多数损伤均可在机体的免疫调节下恢复，但如果调节不当反而会加重炎症反应进一步损伤组织。
1.2 脂多糖与炎症反应
1.2.1 脂多糖的结构与生物学作用
脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也称为内毒素，位于革兰氏阴性菌结构的最外层，LPS通常是革兰氏阴性菌裂解后释放到细胞外，促进炎症因子的生成，从而引发动物机体的炎症反应。LPS主要是通过O-特异性侧链、外核心、内核心和类脂A四个组分共价结合形成的，类脂A是其毒性中心部位，见图1-1[5]。脂多糖作为一种细菌内毒素，在细菌增殖或者死亡时均会被释放，释放后的LPS作用于细胞产生免疫应答反应，进一步释放炎症细胞因子[6]，影响细胞的正常代谢、屏障功能完整性以及引发局部或全身性炎症反应[7]。
2 材料与方法
2.1 瘤胃上皮细胞的原代分离与鉴定
2.1.1 试验材料
瘤胃上皮组织来自内蒙古自治区呼和浩特市玉泉区某屠宰场，屠宰后立即采集其瘤胃组织，用4℃预冷的生理盐水反复冲洗组织，随后放入含有5%双抗、1%两性霉素B、1%庆大霉素的4℃预冷生理盐水中带回实验室备用。
2.1.2 试验试剂
本试验所用试验试剂如表2-1所示。
2.2瘤胃上皮细胞炎症损伤模型的建立
2.2.1 试验材料
试验2.1中分离得到的绵羊瘤胃上皮细胞。
2.2.2 试验试剂
同2.1.2。
2.2.3 试验仪器
同2.1.3。
2.2.4 试验试剂配制
（1）LPS溶液：1 mg LPS粉末溶于1 mL DPBS中，于-20℃保存备用。
其余细胞培养试剂配制同2.1.4。
2.2.5 细胞培养与试验设计
（1）采用单因素完全随机试验设计，将处于生长对数期的第2代瘤胃上皮细胞调整细胞密度后接种于6个不同的96孔板（5000个/孔），放入37℃，5%的二氧化碳细胞培养箱中培养至贴壁，分别加入无血清培养基对细胞进行饥饿培养12 h后，将细胞随机分成对照组（CON组）和5个LPS处理组，每个组5个重复，其中对照组只加入完全培养基，LPS处理组分别加入不同浓度的LPS（1、5、10、50、100 μg/mL），继续培养0、1、3、6、9、18 h，在每个时间结束后使用酶标仪测定490nm处的吸光值，初步筛选LPS最佳刺激时间。在最佳刺激时间下，采用单子随机试验设计，分别加入0、1、5、10、50、100 μg/mL的LPS，培养结束后使用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞相对增殖率，初步确定LPS最佳刺激浓度。
（2）采用单因素完全随机试验设计，将处于生长对数期的第2代瘤胃上皮细胞调整细胞密度后接种于6孔板中（1×105个/孔），放入37℃，5%的二氧化碳细胞培养箱中培养至贴壁，分别加入无血清培养基对细胞进行饥饿培养12 h后，将细胞随机分成对照组（CON组）和4个LPS处理组，每个组3个重复，其中对照组只加入完全培养基，LPS处理组分别加入不同浓度的LPS（1、5、10、50 μg/mL），继续培养2.2.5筛选的时间（1），结束后收集培养上清液用于ELISA检测炎性细胞因子含量，细胞提取RNA用于检测炎性细胞因子的mR NA表达量。
3 结果与分析................................... 29
3.1 绵羊瘤胃上皮细胞的原代分离与鉴定 .................. 29
3.1.1 原代瘤胃上皮细胞形态 ........................ 29
3.1.2 免疫荧光组化鉴定瘤胃上皮细胞 ....................... 29
4 讨论 ...................................... 57
4.1 瘤胃上皮细胞的原代分离与鉴定 ........................ 57
4.1.1 瘤胃上皮细胞的原代分离 ............................ 57
4.1.2 瘤胃上皮细胞免疫荧光组化鉴定 ................... 58
5 结论 ............................ 64
4 讨论
4.1 瘤胃上皮细胞的原代分离与鉴定
4.1.1 瘤胃上皮细胞的原代分离
作为反刍动物独有的器官，瘤胃具有独特的组织结构特点，以实现其复杂的功能为机体提供所需的能量和屏障保护。瘤胃在短链脂肪酸和营养物质的吸收代谢、运输以及防止病原微生物和其他潜在有害物进入体循环等方面起着至关重要的作用。瘤胃上皮是一个分层鳞状上皮结构，从腔内到腔外依次包括基底层、棘层、颗粒层和角质层，每层中的细胞都具有不同的结构和功能特点。基底层细胞中含有丰富的线粒体和其他细胞器，因此被认为对瘤胃上皮的代谢功能贡献最大；与基底层相比，棘层细胞线粒体含量较少，但含有更多的颗粒和丝状聚集体；与棘层相比，颗粒层的细胞含有更大的颗粒，且桥粒和紧密连接最为丰富，因此被认为对瘤胃上皮的屏障功能贡献最大；与内层细胞相比，角质层细胞高度角质化，因此，角质层被认为是对抗磨蚀性瘤胃环境的物理屏障[101]。根据瘤胃上皮细胞结构的不同，在绵羊瘤胃上皮细胞体外分离培养时，选择收集基底层和棘层细胞，活力更高，有利于细胞贴壁进行后续相关试验。目前，反刍动物瘤胃上皮细胞原代分离培养主要包含组织块生长以及胰蛋白酶连续消化两种方法。组织块培养法的优点在于更加接近于组织细胞的原始状态，生长速度快，但会有许多成纤维细胞污染，成纤维细胞生长速度远大于上皮细胞，很难得到纯度较高的瘤胃上皮细胞；分离速度快、纯度较高是胰蛋白酶连续消化法的特点，但胰蛋白酶可能会损害细胞影响后续细胞贴壁生长。Galfi等[104]人在1980首次采用0.25%-0.02%EDTA胰蛋白酶连续消化7次（30 min/次）成功分离获得牛的瘤胃上皮细胞，使瘤胃转运营养物质、挥发性脂肪酸以及屏障功能的深入挖掘及其不利影响因素的体外研究成为可能。金鑫[105]同样采用0.25%-0.02%EDTA胰蛋白酶对绵羊瘤胃组织进行连续消化成功分离得到活力较高的瘤胃上皮细胞。詹康[106]通过0.25%-0.02%EDTA胰蛋白酶连续消化瘤胃上皮组织7次（10 min/次）成功获得活力较高的基底层、棘层细胞。范燕茹等[107]人使用0.25%胰蛋白酶对驯鹿瘤胃组织进行连续消化3~4 h，最终获得驯鹿瘤胃上皮细胞。采用胰蛋白酶消化的重点在于消化时间的把控，一旦消化时间过长细胞表面的黏蛋白将会被破坏影响后续细胞贴壁，甚至死亡。虽然已经有许多学者报道关于瘤胃上皮细胞原代分离培养的方法，但技术依旧不是十分成熟，
