本文是一篇医学论文，本研究在经RT-PCR检测的阳性血清样本中成功分离出一株BVDV-1毒株 “21SD-16”，和一株BVDV-2 毒株“22Anhui-7”，均能使细胞发生病变，在透射电镜下观察到病毒细胞培养物中含有病毒粒子，大小约50~60nm，且有囊膜。
第一章 前言
1.1 牛病毒性腹泻病毒概述
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)是影响全世界牛种最重要的病原之一，能引起严重的牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea，BVD)，也称为牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea- mucosal disease, BVD-MD）。BVD是一种以腹泻、黏膜感染以及繁殖障碍为主的急性传染病[1]，属于二类传染病，各个年龄段的牛都易感染BVDV，但以幼龄动物易感性最高[2]。BVDV在家畜中高度流行，感染范围广泛，在绵羊、山羊、鹿、骆驼等反刍动物以及猪中都能检测到[3]。已从家养和野生反刍动物中鉴定出多种瘟病毒的种类，包括从澳大利亚的猪中分离出的“Bungowannah”病毒[4]、在欧洲、亚洲和南美洲发现的非典型“HoBi-样”病毒[5]、叉角羚病毒和来自肯尼亚的“长颈鹿”病毒[6]。BVD暴发后的控制成本巨大，具有重要的经济意义，目前，欧洲、美国和英国的大部分地区都制定了BVD的控制和根除计划，澳大利亚和新西兰等其他国家也在积极探索控制BVD的方案，然而却没有一种能彻底控制和消灭BVDV的方法[7]。现有研究[8]已证明识别和消除持续性感染（Persistent infection, PI）的动物是控制BVDV最常见和最有效的方法，但即使识别和消除PI动物，也有病毒持续存在的情况。
自1946年，研究人员[9]在美国的一群患有高致死急性胃肠炎的牛中首次发现BVDV以来，BVDV成为世界范围内感染牛的一种重要病原体。大部分经济损失由BVDV干扰牛繁殖造成，可造成不孕、流产、产死胎、畸形胎和PI犊牛出现，牛病毒性腹泻病毒对牛的健康产生的重大影响也会导致产奶量减少并影响奶制品的质量，严重影响着养牛业的发展。研究人员[10]于1957年分离鉴定了BVDV毒株，在我国，李佑民[11]等于1983年首次在长春牛流产胎儿中分离出一株BVDV毒株，命名“长春184V株”。随后，我国多地出现BVDV感染，严重影响养殖业的发展。因此，对BVDV的检测，分离鉴定以及基因分型可为我国BVDV的监测提供基础，并为BVDV的控制计划提供信息，也可推动疫苗开发。
1.2 牛病毒性腹泻病毒感染的病理特征
易感动物感染BVDV的结果主要取决于动物的繁殖状况，怀孕母牛感染BVDV可能导致几种疾病综合征，包括早期胚胎死亡、对胎儿的致畸作用和PI牛的产生。研究表明牛对BVDV的易感性主要与牛2号染色体和26号染色体上的一些位点有关，这种遗传倾向可能与个别牛而不是特定品种的牛有关[15]，并且研究人员发现CD46分子在病毒进入过程中充当BVDV受体，“NADL-BVDV”毒株能够通过CD46非依赖性机制从感染细胞传播到易感细胞[16]。
尸检时，通常难以区分是BVDV-1还是BVDV-2引起的重度急性BVD和黏膜病（Mucosal disease, MD），唯一的例外是与血小板减少综合征相关的重度急性BVD，其具有由BVDV-2强毒株引起的显著出血性病变[17]。动物感染BVDV主要的病理学发现包括舌、牙龈、硬腭、食管黏膜、瘤胃柱、皱胃和小肠黏膜的黏膜充血、背部和侧面上皮的溃疡，最常见的是存在几种不同直径的血凝块附着在回肠黏膜上，其中一些在解剖学上与派尔集合淋巴结相关[18]。一般来说，感染BVDV引起的呼吸道疾病包括间质性肺气肿、肺炎和纤维蛋白性胸膜粘连，在鼻腔和气管中可观察到急性卡他性炎，肺部也可能存在中度拥挤和淋巴细胞间质反应[19]。而在流产胎儿中，组织病理学变化有外胚层损耗和小脑组织的坏死，主要病变包括结膜炎、肺炎、胸腺发育不全和非特异性心肌炎，胎盘病变主要包括水肿、血管炎、坏死、充血、出血和变性[20]。感染BVDV后显微镜观察显示主要的损害部位在外周和全身淋巴结以及派尔集合淋巴滤泡中有严重的淋巴细胞耗竭和出血，舌和食管鳞状上皮存在上皮细胞坏死和空泡化[21]。除此之外，瘤胃上皮可出现细胞坏死、淋巴细胞浸润，伴有轻度非化脓性炎症反应，肠系膜和黏膜下小动脉透明变性和纤维素样坏死性血管炎，Lieberkuhn式隐窝上皮空泡化是小肠、盲肠和结肠中的显著病症，受影响的隐窝可以扩张，混合中性粒细胞和巨噬细胞（隐窝炎），并含有大量的细胞碎片[20]。
第二章 牛病毒性腹泻病毒检测及分离鉴定
2.1试验材料
2.1.1 血清、病料和细胞系
2021-2022间采自我国4个省的676份血新生牛血清样本，其中宁夏376份，陕西100份，山东100份，内蒙100份。牛肾细胞(Madin-Darby Bovine Kidney Cell, MDBK)由本实验室保存。
2.1.2 主要试剂
2.2试验方法
2.2.1 RT-PCR检测样品
2.2.1.1 BVDV检测引物设计
根据GenBank已公布的BVDV参考毒株的序列信息，应用Primer Premier 5.0软件为工具设计一对特异性5′-UTR检测引物(F：5′-GCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′; R：5′-CACCCTATCAGGCTGTRTYC-3′)，送西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成，预期片段大小约为250 bp。
2.2.1.2 样品RNA的提取
按照RNAprep Pure高效总RNA提取试剂盒进行如下操作：
（1）吸取待检测样品200 μL到1.5 mL离心管中，向其中加入600 μL裂解液RLH（使用前加入β-巯基乙醇），涡旋混匀。 （2）将溶液转移至有过滤柱CS的收集管中，12000 rpm/min离心2 min，弃掉过滤柱CS，收集滤液。 （3）向滤液中加入700 μL70%乙醇，混匀，将溶液移到含有吸附柱CR4的收集管中，12000 rpm/min 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。 （4）加入700 μL已加乙醇的去蛋白液RW1H于吸附柱CR4中，12000 rpm/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。 （5）加入500 μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)于吸附柱CR4中。室温静置2 min，12000 rpm/min 离心1 min，弃掉滤液，将吸附柱CR4放回收集管中。 （6）重复步骤（5）。 （7）12000 rpm/min离心2 min。将吸附柱CR4的盖子打开，室温静置6 min，彻底晾干残余的漂洗液。 （8）丢掉收集管，将吸附柱CR4装入一个新的1.5 mL RNase-Free离心管中，加入50 μL RNase-Free ddH2O，室温静置2 min，12000 rpm/min 离心2 min，滤液即为RNA溶液，测浓度，-80℃保存备用。
第三章 BVDV NS5A 抗原表位的分析及真核表达质粒的构建 ........ 34
3.1 试验材料 ........................ 34
3.1.1 材料 ..................................... 34
3.1.2 主要试剂 ........................... 34
第四章 Ⅰ型和Ⅱ型 BVDV NS5A 对 IRES 介导的翻译调控的影响 ................................ 49
4.1 试验材料 ................................. 49
4.1.1 细胞、菌株、质粒 ..................... 49
4.1.2 主要试剂 ......................... 50
第五章 结论....................... 60
第四章 Ⅰ型和Ⅱ型BVDV NS5A对IRES介导的翻译调控的影响
4.2 试验方法
4.2.1 双报告质粒pcDNA3.1（＋）-EGFP-IRES-Npro-flag的构建
4.2.1.1 引物设计
根据pcDNA3.1（＋）载体的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，下划线为Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点，引物由西安擎科泽西生物技术有限公司合成，结果如下所示：
第五章 结论
1. 本研究在经RT-PCR检测的阳性血清样本中成功分离出一株BVDV-1毒株 “21SD-16”，和一株BVDV-2 毒株“22Anhui-7”，均能使细胞发生病变，在透射电镜下观察到病毒细胞培养物中含有病毒粒子，大小约50~60nm，且有囊膜。按Karber法计算其TCID50分别为106.2TCID50/0.1mL和108.3TCID50/0.1mL。
2. 对分离到的病毒株“21SD-16”和“22Anhui-7”进行全基因组序列的扩增，系统发育进化树显示“21SD-16”与BVDV-1“Bega-like”的相似性较高，为93.4%，“22Anhui-7”与BVDV-2“GS2018” 的相似性较高，为99.7%。
3. 通过分析BVDV-1和BVDV-2 NS5A抗原性及二级结构和三级结构，构建真核表达载体pcMV-c-flag-NS5A和以BVDV IRES顺时作用元件的双报告载体pcDNA3.1（＋）-EGFP-IRES-Npro-flag，通过Western-blot分析发现I型和Ⅱ型BVDV非结构蛋白NS5A均可抑制I
