研究大鼠牙囊细胞集落刺激因子1受体

研究大鼠牙囊细胞集落刺激因子1受体

【摘要】　目的研究不同浓度集落刺激因子1帮写医学论文 (colony-stimulating factor-1,CSF-1)、白细胞介素1α(interleukin-1α,IL-1α)对大鼠牙囊细胞CSF-1受体基因表达的影响;明确CSF-1自分泌作用的抑制机制,为研究细胞因子在牙齿萌出和牙槽骨吸收中的作用奠定基础。方法　间接免疫酶标法检测体外培养牙囊细胞,以及出生后不同时期牙囊组织中CSF-1受体蛋白表达。逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR)检测在细胞培养液中分别加入不同浓度CSF-1、IL-1α对牙囊细胞CSF-1受体基因表达的影响。结果　间接免疫酶标法染色显示CSF-1受体蛋白在生后早期牙囊中染色明显,10 d后染色不明显或者完全无染色,高浓度CSF-1作用下,牙囊细胞CSF-1受体mRNA表达明显消失。不同浓度IL-1α作用后,CSF-1受体mRNA水平保持不变。结论　CSF-1受体蛋白在出生后早期牙囊中表达明显,随后逐渐消失。高浓度CSF-1抑制CSF-1受体基因的表达,不同浓度IL-1α对牙囊细胞CSF-1受体mRNA表达无影响。

【关键词】　大鼠,Sprague-Dawley;　牙囊;　牙萌出;　受体,集落刺激因子

近年来研究发现集落刺激因子1 (colony-stimulating factor-1,CSF-1)是启动牙齿萌出的一种极为重要的调控分子,其在细胞水平上是单核细胞的趋化物,并可促进单核细胞分化成破骨细胞[1]。进一步研究表明,给正常大鼠体内注射CSF-1可增加牙囊单核细胞和破骨细胞的数目,并加速骨的吸收和牙齿的萌出[2]。在大鼠牙囊组织中,CSF-1受体mRNA的表达高峰为出生后第3天,之后其水平逐渐下降[3]。我们通过对大鼠体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞中CSF-1受体分布的检测,及不同浓度CSF-1、IL-1α对体外培养的牙囊细胞CSF-1受体mRNA表达影响的研究,进一步明确牙齿萌出的分子调控机制。

材料和方法

1·牙囊细胞的培养:取10只新生6~7 d的SD乳鼠(釉质分泌阶段)下颌骨,在解剖显微镜下分离出附有牙囊的第一、二磨牙成釉器,用胰蛋白酶消化,进一步在解剖显微镜下分离牙囊与星网状层,培养在15%的MEM培养基中,将培养到第3或4代的牙囊细胞进行以下研究。

2.CSF-1受体的免疫检测及定位:

(1)体内CSF-1受体的免疫检测及定位:牙囊组织切片的制作:取出生1~11 d的SD乳鼠,引颈处死,取下颌骨,截取第一磨牙牙胚段,立即置入10%中性甲醛固定液,4℃条件下固定24 h,然后置入5%甲酸溶液,4℃条件下脱矿3~5 d,不同梯度乙醇脱水,石蜡包埋,制作5μm厚的石蜡切片。采用间接免疫酶标法检测CSF-1受体:PBS洗涤切片3min×2; 3%H2O2,室温10 min,PBS洗涤3 min×2;0·2%Triton X-100,室温5 min,PBS洗涤3 min×2;20%胎牛血清,室温饱和湿度条件下孵育20 min;滴加兔抗大鼠CSF-1受体多克隆抗体(购于Santa公司),37℃饱和湿度条件下孵育1 h; PBS洗涤3 min×3;滴加过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(购于武汉博士德公司),37℃饱和湿度条件下孵育1 h;PBS洗涤3 min×3;0·04%DAB+0·03% H2O2显色5~10min;流水冲洗;苏木素复染60 min,常规脱水、透明、中性树胶封片。光学显微镜下观察、拍照。阴性对照组不滴加兔抗大鼠CSF-1受体多克隆抗体,其余处理同实验组。

(2)体外CSF-1受体的免疫检测及定位:实验对象为第3或4代牙囊细胞,方法及所用试剂均同上。以上实验均重复3次。

3.RT-PCR:

(1)CSF-1、IL-1α溶液的配制:取CSF-1、IL-1α粉剂(购于PeproTech公司)各2μg,用1% MEM培养基分别制备0·4、2、10、50、100μg CSF-1/L和0·4、2、10、50μg IL-1α/L。

(2)用含处理因子的培养基孵育牙囊细胞:为检测不同浓度CSF-1对CSF-1受体基因表达的影响,取第4代牙囊细胞6瓶(每瓶细胞量达4×106/25cm2),弃去瓶内旧培养基,对照组瓶内加入1%MEM培养基(含1%胎牛血清)3 ml,其余5瓶分别加入含上述5个不同浓度CSF-1的1%MEM培养基3 ml,然后置入细胞培养箱孵育6 h。检测不同浓度IL-1α对CSF-1受体基因表达的影响,取上述牙囊细胞5瓶,方法同上,实验组加入上述4种不同浓度的IL-1α。

(3)引物的合成:由上海生物工程公司合成。CSF-1受体引物:上游引物:5TCAGAGTGATGTGTGGTCCTACGGCCCACCTGTCCCAAGAAGCCTGTAG-3′。

(4)提取每个样本细胞的总RNA:0·125%胰蛋白酶和0·02%EDTA(1∶1)液消化、离心、收集细胞;采用试剂一步法Trizol提取细胞总RNA。

(5)cDNA的合成:ThermoScriptTMRT-PCR System由美国Invitrogen公司提供,操作按说明进行。

(6)PCR条件:94℃预变性2 min,94℃变性30min,59℃退火45 min,72℃延伸2 min,35个循环,72℃延伸8 min。实验过程中以β-actin为内参照。

(7)PCR产物凝胶电泳:用1·5%琼脂糖凝胶作TAE电泳,从CSF-1处理的6个PCR产物样本中各取7μl,分别加入3μlβ-actin PCR产物及2μl 6×上清样缓冲液,以2μl 100 bp DNALadder作为参照,混匀,恒压66 v电泳1 h。在紫外透射仪下观察,UVP凝胶图像分析系统成像。IL-1α处理组同上作凝胶电泳、成像。以目的基因与β-actin的灰度比进行半定量分析。以上实验重复3次。

4.统计学方法:应用SPSS10·0统计软件,采用双因素相关分析。

结果

1.体内CSF-1受体免疫定位:新生第1天SD乳鼠,免疫组化染色显示下颌第一磨牙的牙囊为阳性反应,呈棕黄色,表明牙囊表达CSF-1受体蛋白(图1)。第3天牙囊染色较第1天深(图2)。第5天牙囊染色呈棕褐色,比第3天颜色深(图3)。第7天牙囊仍呈棕黄色,颜色浅(图4)。第10天牙囊仅有轻微染色(图5)。第11天牙囊染色不明显甚至无染色。对照组牙囊及其他组织均无染色,呈阴性反应(图6)。

2.体外CSF-1受体免疫定位:间接免疫酶标法显示,牙囊细胞CSF-1受体蛋白染色呈阳性反应,胞质为棕褐色(图7),对照组为阴性(图8)。

3.不同浓度CSF-1、IL-1α对牙囊细胞CSF-1受体基因表达的影响:不同浓度CSF-1作用于牙囊细胞6 h后,在800 bp处各处理组呈现强度不同带形。CSF-1对CSF-1受体基因mRNA水平有下调作用且有浓度依赖性(r=-0·89,P=0·015)。不同浓度IL-1α作用于牙囊细胞6 h后,在800 bp处各处理组有强度相同带形。IL-1α对牙囊细胞CSF-1受体基因mRNA的表达无影响(r=0·21,P>0·05)。

讨论

CSF-1受体由原癌基因c-fms转录而来,属于一种单链糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性。在大鼠下颌第一磨牙牙囊组织中,CSF-1受体mRNA的表达高峰为出生后第3天,随后转录的mRNA量降低,第9天时转录的mRNA消失[4]。本研究免疫组化染色显示,出生早期几天大鼠下颌第一磨牙牙囊CSF-1受体蛋白染色较深、表达量高,出生后第10及11天,其表达明显下降甚至消失。第7天,CSF-1受体免疫组化染色仍为阳性。经重复检测,定性地反映出在出生后第5天时,受体染色最明显,呈强阳性。比较第1~11天免疫组化染色结果,显示大鼠出生后前几天牙囊CSF-1受体蛋白表达量较高。

体内免疫组化染色显示,CSF-1受体蛋白与CSF-1受体mRNA表达相似,均在大鼠出生早期牙囊中呈现高峰,提示CSF-1在牙囊中起作用最强的时期是在出生后早期几天内。其原因可能是单核细胞进入牙囊的高峰期恰好是大鼠出生后第3天,此时牙槽骨中破骨细胞的数目也达高峰[5]。这些细胞因子的早期表达,可能与调控牙齿萌出通道形成的细胞相关联。

Guilbert和Stanley[6]研究发现,骨髓源性巨噬细胞与CSF-1接触时,CSF-1受体迅速下调。Amano等[7]亦证明用含CSF-1的培养基孵育破骨细胞时,CSF-1受体下调。去除CSF-1对破骨细胞的作用,CSF-1结合位点会在数小时内恢复到原水平。本实验中,将细胞培养于含有不同浓度CSF-1的培养基中,随着CSF-1浓度的增高,RT-PCR显示CSF-1受体mRNA的表达没有增高,相反当培养基中CSF-1浓度达到50μg/L或高于此浓度时,CSF-1受体mRNA的表达明显减少或消失。提示CSF-1不能促进CSF-1受体合成,高浓度的CSF-1可抑制CSF-1受体基因表达,CSF-1受体mRNA表达高峰与CSF-1无明显关系。

Wise等[4,5]认为CSF-1受体基因表达水平下降,可能是CSF-1自分泌作用的抑制机制之一。牙囊细胞在含CSF-1的培养基中培养,CSF-1促进牙囊细胞表达其自身基因,出生3天后其基因表达和蛋白合成均减少,表明其自分泌作用受到抑制。本实验免疫组化结果显示,CSF-1受体位点在出生10 d后明显消失。CSF-1基因和蛋白表达下降的同时,伴有CSF-1受体数目的减少,即与配体结合的受体位点数目减少,受体位点的减少又会限制CSF-1自分泌作用。

也有学者用CSF-1孵育破骨细胞或巨噬细胞发现,CSF-1受体显著