同源盒基因Msx-1、Msx-2和Dlx-2在小鼠下基因表达调控
【摘要】 目的观察同源盒基因Msx-1、Msx-2帮写医学论文和Dlx-2 mRNA在小鼠下颌第一磨牙发育阶段的表达。方法 取胎龄E11~E18和新生P1~P3小鼠的头或下颌,制备5μm连续冠状切片。体外转录合成地高辛标记的Msx-1、Msx-2和Dlx-2 RNA探针。原位杂交后观察Msx-1、Msx-2和Dlx-2在小鼠下颌第一磨牙中的表达。结果 在牙胚发育过程中,Msx-1转录信号始终只在间质细胞中观察到,在上皮细胞中呈阴性。Msx-2和Dlx-2在牙源性上皮和间质中均表达,在磨牙发育起始期二者表达相似,但在随后的牙胚发育过程中,它们出现不同的表达特征。结论 牙胚发育过程中,Msx-1、Msx-2和Dlx-2有不同的表达特征,可能共同参与调控上皮和间质间的相互作用。
【关键词】 牙胚; 基因,同源盒; 原位杂交; 基因表达调控
哺乳动物的牙胚发育是上皮和间质组织相互作用的结果[1,2]。牙胚最早的形态学发生出现在上皮组织中。同源盒基因(homeobox gene)是一类在动物进化过程中具有高度保守性的转录调控基因,最初在果蝇(drosophila)中发现,它们编码的转录因子参与调控果蝇体节的发育形成,后来在脊椎动物中也发现了类似控制发育的基因[3]。哺乳动物牙胚发育过程中,同源盒基因受信号分子激活,编码转录因子,这些转录调控蛋白具有特殊的DNA结合域,可与下游调控基因的启动子或增强子结合,从而启动或调控这些基因的转录。同源盒基因Msx和Dlx家族成员被认为是调控牙胚发育的最佳候选基因[2-4]。脊椎动物Msx同源盒序列与果蝇Msh (musclesengment homeobox)相关,现已发现3个家族成员,分别为Msx-1、Msx-2和Msx-3。Msx-1和Msx-2在胚胎多个区域表达,包括神经管、神经脊、面突和四肢胚芽,而Msx-3只在背侧神经管中表达[5-7]。同源盒基因家族Dlx至少有6个基因成员:Dlx-1、2、3、5、6、7,其同源盒编码序列与果蝇Dll基因相似。小鼠Msx-1、Msx-2和Dlx-2蛋白编码基因分别定位于染色体5、13和2[8,9]。同源盒基因Msx-1、Msx-2和Dlx-2参与调控牙胚发育,它们在牙胚发育过程中表达模式的确定对进一步研究上皮和间质作用的分子调控机制具有重要意义。关于Msx-1、Msx-2和Dlx-2在鼠牙胚中表达模式的研究有许多报道,但结果不尽相同。为此,我们用mRNA原位杂交方法检测并比较了Msx-1、Msx-2和Dlx-2在下颌第一磨牙发育早期的表达,以期确定这3种基因的表达模式。
材料和方法
1.组织标本的收集:成年未交配过的昆明小鼠(湖北医学科学院实验动物中心)雌雄同笼交配24 h,第2天观察见到阴道栓,计为零天(E0)。在胚胎第11天到出生后第3天(E11~18,P1~3)断颈处死母鼠,分离鼠胚的头或下颌骨,4%多聚甲醛4℃固定24 h,制备5μm厚连续冠状切片。
2.RNA探针的制备和原位杂交检测:根据Meltzer等[10]方法,用限制性内切酶BglⅡ,HindⅢ和EcoRⅠ分别将质粒pSP72-Msx1, pSP72-Msx2和Bluescript-Dlx2线性化,Sp6,T7,T3 RNA聚合酶体外转录分别合成地高辛标记的反义Msx-1、Msx-2和Dlx-2 RNA(Boehringer Mannheim′s DIG RNA labelingkit),同样方法合成正义RNA,水解合成RNA探针。依据Bloch-Zupan等[11]方法,用地高辛标记的RNA探针杂交,先后用RNA酶和阻断剂处理后,滴加抗地高辛抗体孵育,抗体反应用BCIP/NBT显色,核快红复染。阳性显蓝黑色。本实验对照组为:①杂交前用RNA酶消化组织mRNA后,再用反义探针杂交;②用正义探针杂交。
结果
1.质粒酶切后显示1条电泳带,证明线性化成功。
2.原位杂交对照组未见到杂交信号。反义探针杂交的结果显示Msx-1,Msx-2和Dlx-2在小鼠下颌第一磨牙发育过程中,有特异的时空表达特征:①E11~12为起始期,小鼠下颌第一磨牙发生区上皮增厚,向间质中内陷。Msx-1在增生的上皮中为阴性,但在周围间质中呈阳性。Msx-2和Dlx-2在增厚的上皮和周围间质细胞中均可检测到。②E13~14为蕾状期,Msx-1在浓缩的间质细胞中杂交信号很强,在成釉器中呈阴性。Msx-2在成釉器中检测到杂交信号很强,在邻近成釉器的间质细胞中也有阳性表达,但信号很弱。Dlx-2在成釉器和间质组织中也可检测到,但在牙蕾尖部邻近的间质组织中阳性表达更强。③E15~16为帽状期,成釉器分化为内釉上皮、中间层、星网状层及外釉上皮细胞。Msx-1在牙乳头和牙囊浓缩的间质细胞中呈强阳性,但在上皮组织中呈阴性(图1)。Msx-2在成釉器和牙乳头细胞中表达呈阳性,在釉结中的杂交信号突出,在牙囊中也有很弱的阳性表达(图2)。Dlx-2在牙乳头间质细胞、内釉上皮和中间层细胞中呈阳性,在牙乳头中的杂交信号很强,且表达范围较广(图3)。④E17~P3为钟状期,Msx-1 mRNA杂交信号局限在牙乳头和牙囊的间质细胞中(图4)。Msx-2在中间层细胞和牙尖部内釉上皮细胞及其邻近的牙乳头间质细胞中呈强阳性,在牙囊中也有很弱的杂交信号。Dlx-2在成釉器和牙乳头间质中均有阳性杂交,牙乳头中的杂交信号更突出,且表达范围比Msx-2更广。钟状晚期(P2~3),成牙本质细胞和成釉细胞先后分化形成,在牙乳头细胞分化形成的成牙本质细胞中Msx-2呈强阳性表达,但Dlx-2呈阴性,由内釉上皮分化而成的成釉细胞中Dlx-2的转录信号很强,而Msx-2 mRNA呈阴性。
讨论
Msx-1是第一个在发育的牙胚上定位的同源盒基因。1991年Mackenzie等[5]检测到磨牙发育蕾状期Msx-1在牙乳头和牙囊中mRNA信号最强,钟状早期成牙本质细胞和成釉细胞未开始分化形成前,Msx-1信号逐渐减弱,在牙乳头和牙囊中无明显定位标记。1992年MacKenzie等[6]又检测了Msx-1和Msx-2,发现整个牙胚发育过程中,一直到分化期,成牙本质细胞和成釉细胞已完全分化,Msx-1始终在间质细胞中有很强的表达,Msx-2在上皮细胞和间质细胞中均有表达。Jowett等[12]检测到,Msx-2在牙胚上皮细胞和牙乳头间质细胞中呈阳性表达,在牙囊间质细胞中Msx-2呈阴性。Thomas等[13]完成的免疫组化结果显示:Msx-2和Dlx-2转录蛋白的表达在牙胚发育分化期有显著差别,Msx-2蛋白表达在成牙本质细胞中很强,在成釉细胞中呈阴性,Dlx-2在成釉细胞中呈阳性,在成牙本质细胞中蛋白表达呈阴性。王颖莉等研究发现,在磨牙形态形成早期(E12·5~14·5),Msx-1主要在牙胚间质中表达,Msx-2 mRNA在牙胚上皮细胞和间质细胞中均有表达。牙胚发育晚期(E15·5~17·5),Msx-1在成釉器上皮细胞和牙乳头间质细胞中同时出现表达,且强度几乎一致。Msx-2 mRNA同时表达于成釉器上皮细胞和牙乳头间质细胞,以及刚开始分化的成釉细胞和成牙本质细胞中。在分化和分泌阶段(E19·5~P3),Msx-2 mRNA在成釉细胞和成牙本质细胞中均有很强的表达。
本研究结果显示,在小鼠下颌第一磨牙发育过程中,从起始期到分化期(E11~P3),Msx-1杂交信号始终只在间质源性的细胞中呈阳性,在上皮细胞中呈阴性。这与MacKenzie等研究结果相符,提示该基因为间质特异性的同源盒调控基因。
本研究还发现,在牙胚发育起始期牙胚上皮细胞和间质细胞中均可检测到较强的Msx-2和Dlx-2mRNA杂交信号,且二者表达相似。随着牙胚的进一步发育,Msx-2和Dlx-2基因表达模式开始出现显著差异,尤其在钟状晚期,当成牙本质细胞和成釉细胞分化成熟后,Msx-2和Dlx-2表达出现明显差异。在成牙本质细胞中可观察到很强的Msx-2 mRNA信号,而Dlx-2 mRNA呈阴性,成釉细胞中Dlx-2转录信号很强,而Msx-2 mRNA呈阴性。这两种基因在早期相同而晚期不同的表达特征提示二者在牙胚发育晚期,可能对细胞的分化成熟或牙本质基质的分泌形成存在不同的诱导或其他调控作用。综上所述,在小鼠下颌第一磨牙发育过程中,这3种基因在上皮-间质相互作用中发挥着重要的调控作用。
参考文献
1帮写医学论文朱奇,樊明文,张旗,等.半固态培养基法培养鼠磨牙牙胚的实验观察.口腔医学纵横,2000,16:254-256.
2 Nieminen P, PekkanenM, AbergT, et al. Agraphical WWW-databaseon gene expression in teeth. Eur J Oral Sci, 1998, 106(Suppl 1):7-11.
3 Line SR. Molecular morphogenetic fields in the development of humandentition. J Theor Biol, 2001, 211: 67-75.
4 WeissK, Stock D, Zhao Z, et al. Perspectives on genetic aspects ofdental patterning. Eur J Oral Sci, 1998, 106(Suppl 1):55-63.
5 Mackenzie A, Leemin
