套式PCR检测唾液中变形链球菌及远缘链球菌差异

 套式PCR检测唾液中变形链球菌及远缘链球菌差异

【摘要】　目的探索一种快速、简便地从人类唾液中同时检测变形链球菌和远缘链球菌的方法。医学论文发表方法分别以变形链球菌gtfI和远缘链球菌gtfB基因设计两组成套引物,首先用套式PCR(二次PCR)检测变形链球菌和远缘链球菌标准株和临床株,然后用套式PCR直接从唾液中检测这两种细菌。结果　变链菌(血清型c,e,f)的标准株及临床株第1次PCR扩增产物为517 bp,第2次扩增产物为468 bp;远缘链球菌(血清型d,g)及道勒链球菌(血清型h)的标准株及临床株第1次PCR扩增产物为712 bp,第2次扩增产物为663 bp;其他异种菌均不能扩增出产物,因此该PCR检测具有高度的特异性。细菌纯培养物及唾液PCR检测的敏感性分别是:第1次PCR为105CFU,第2次PCR为103CFU。结论　套式PCR能快速在人类唾液中同时检测变形链球菌和远缘链球菌。该检测方法有望运用于临床检测,对揭示两种细菌与龋病发生关系的研究具有一定价值。

【关键词】　聚合酶链反应;　唾液;　链球菌,变异

以往研究表明,在变形链球菌群中变形链球菌(S·mutans,简称变链菌,血清型c,e,f)为人类的最主要致龋菌,检出率最高;而远缘链球菌(S·sobrinus,血清型d,g)检出率较低,甚至在某些个体中只能检出变链菌[1,2]。但近来有报道,常规轻唾-杆菌肽琼脂(MSBA)培养可能抑制远缘链球菌的生长,影响其检出率;与变链菌相比,远缘链球菌可能具有更强的致龋潜力,对龋病的发生和活跃性可能更为重要[3,4]。也有学者持不同意见[5]。因此,鉴定变链菌和远缘链球菌,研究人类口腔中这两种细菌检出率的差异,对探索两种细菌与龋病关系非常重要。以往区分和鉴定变形链球菌和远缘链球菌的方法(如观察菌落形态、生化鉴定、免疫血清学鉴定、DNA探针等)费时且灵敏度不高。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)在检验致病菌方面具有简便、省时、敏感等优点[6,7]。其中,套式PCR可明显提高PCR检测的特异性和敏感性[8]。研究表明唾液中致龋微生物水平与牙菌斑中的水平呈正相关,且唾液样本适合于致龋微生物的定量检测[9]。我们运用套式PCR技术,检测人类唾液中变形链球菌和远缘链球菌,旨在探求一种适合临床应用、快速敏感的致龋微生物检测方法。

材料与方法

一、主要试剂

1·引物:分别以变形链球菌gtfI和远缘链球菌gtfB基因设计两组成套寡核苷酸引物。由GIBCOBRL公司合成(表1)。　　

2·试剂:溶菌酶液,蛋白酶K液,苯酚、氯仿(1∶1),PCR试剂(Taq酶,4种dNTP混合物等)。二、细菌标准株细菌均系武汉大学口腔医学院中心实验室收藏保存菌株。所使用的变链菌属(血清型a~h)为:仓鼠链球菌(S·cricetus)AHT(血清型a),鼠链球菌(S·rattus) BHT(血清型b);变链菌(S·mutans,血清型c)Ingbritt,GS-5, Kpsp2, ATCC10449, UA96, UA159;变链菌(血清型e) LM7, MT703;变链菌(血清型f) OMZ175, MT6219;远缘链球菌(S·sobrinus,血清型d)OMZ176, B13;远缘链球菌(S·sobrinus,血清型g) OMZ65, 6715;道勒链球菌(S·downei,血清型h) MFe28。非变链菌属:唾液链球菌(S·salivarius)HB, HBC12;口腔链球菌(S·oralis) ATCC10557;轻链球菌(S·mitis)ATCC9811;血链球菌(S·sanguis)903;格登链球菌(S·gordonii) V288;粘性放线菌(A·vicosus)ATCC19246, ATCC29525;大肠杆菌(E·coli)JM109, DH5α;牙龈卟啉菌(P·gingivalis)ATCC33277;假单胞菌(Pseudomonas) AB93065,AB93077,AB90024,AB90056,AB90057,AB94179。

二、方法

1·研究对象:选择武汉大学口腔医学院研究生10名,编号为A~J。

2·唾液样本收集:据Hirose等[3]方法,于餐后2h采用吐唾法收集无刺激全唾液,一式两份。

3·分离、纯化、鉴定变链菌和远缘链球菌临床菌株:将所收集唾液分别于振荡器上充分混匀,并在磷酸钠缓冲液中系列稀释后取100μl稀释菌液分别涂布于MSBA平皿。于厌氧罐中,37℃、95%N2、5%CO2培养48 h。观察细菌生长情况,根据体现显微镜下典型菌落形态初次鉴定变形链球菌和远缘链球菌。将典型菌落作次代培养,获得纯培养后作生化鉴定(精氨酸、七叶苷水解、山梨醇、甘露醇、密二糖、棉子糖发酵)。

4·细菌染色体DNA的提取:1 ml细菌隔夜培养物,8 000 r/mim离心,4℃10 min,去上清,200μlTE缓冲液冲洗2次,将沉淀重悬于内含2 mg溶菌酶的200μlTE液中,37℃,1 h,加40μg蛋白酶K,并加入10%SDS 45μl(终浓度1·5%),混匀,37℃,2 h,等体积苯酚、氯仿抽提2次,乙醇沉淀DNA,离心10 000r/min,10 min,弃上清,70%乙醇洗涤,溶于TE缓冲液中。

5·直接从唾液中提取细菌染色体DNA:1 ml唾液,8 000 r/min,4℃离心,15 min,去上清,500μlTE缓冲液洗2次,将沉淀重悬于内含2 mg溶菌酶的200μlTE液中,其余步骤同4。

6·套式PCR扩增:第1次PCR:依次加入两对外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50 pmol,4种dNTP混合物(每种终浓度200μmol/L)4μl,10×反应缓冲液5μl,Mg2+溶液3μl,模板DNA2μl,TaqDNA聚合酶2·5 U,灭菌水33μl,混匀后加无菌石蜡油30μl。反应按94℃预变性4 min,94℃变性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环30次,最后72℃延伸5min。第2次:将第1次PCR产物取2μl,稀释10倍,取2μl作模板,以thp7、thp8、thp9、thp10各50 pmol,其他成分及步骤同第1次PCR。

7·PCR反应敏感性检测:PCR检测靶细菌纯培养物的敏感性:将2 ml变链菌Ingbritt株(或远缘链球菌6715株)隔夜培养物分为1 ml菌液2份,10倍系列稀释后,提取Ⅰ组系列稀释菌液的染色体DNA作为模板进行PCR;将Ⅱ组系列稀释菌液分别涂布于MSBA平皿,培养48 h后CFU计数。PCR检测唾液中靶细菌的敏感性,参照Matto等[10]方法,将已知变链菌和远缘链球菌量的唾液系列稀释后作为模板,PCR检测其敏感性。

8·扩增产物检测:取扩增产物5μl,1·0%琼脂糖(0·5 mg EB/L)凝胶电泳,电压80 V,以DL2 000DNA Marker为标准对照,用紫外检测仪观察扩增带。

结果

一、PCR反应的产物获得及特异性变形链球菌群中,变链菌(血清型c,e,f)第1次PCR扩增产物为517 bp,第2次PCR扩增产物为468 bp;远缘链球菌(血清型d,g)及道勒链球菌(血清型h)第1次PCR扩增产物为712bp,第2次PCR扩增产物为

663 bp;而仓鼠链球菌(血清型a)、鼠链球菌(血清型b)无扩增产物。非变链菌组的细菌没有任何扩增产物,可见该PCR反应对变链菌和远缘链球菌具特异性。

二、PCR反应敏感性变链菌及远缘链纯培养物的敏感性:套式PCR的第1次反应需要105CFU变链菌(或远缘链球菌)才能扩增出特异性产物;第2次仅需103CFU靶细菌。唾液中靶细菌的敏感性:第1次PCR敏感性为

105CFU靶细菌;第2次为103CFU靶细菌。

三、PCR检测临床菌株

1:唾液链球菌HB;　

2.唾液链球菌HBC 12;　

3.口腔链球菌ATCC 10557;　

4.轻链球菌ATCC 9811;　

5.血链球菌903;　

6.格登链球菌;　

7.粘性放线菌ATCC 19246;

8.轻链球菌ATCC 29525;　

9.大肠杆菌JM 109;　

10.大肠杆菌DH 5α;　

11.牙龈卟啉菌ATCC 33277;　

12假单胞菌AP 930065;　

13.变链菌Ingbritt;

14.远缘链球菌6715

　 以thp3, thp4, thp5, thp6为引物,不同细菌DNA为模板的PCR产物凝胶电泳图从10位研究对象的唾液中分离的变链菌20株,远缘链球菌15株,经提取DNA,进行PCR反应后,均有其特异性产物。

四、PCR检测唾液样本

以唾液为模板PCR扩增产物的片段大小与变链菌和远缘链球菌标准株和临床株DNA为模板的完全一致。PCR检测唾液样本的典型结果为: A在第1次PCR反应中扩增出变链菌的特异性产物,第2次PCR反应中扩增出远缘链球菌的特异性产物;B两次PCR仅扩增远缘链球菌的特异性产物; C两次PCR均可扩增出变链菌和远缘链球菌的特异性产物(图4,5)。据以上关于该PCR反应敏感性的结果推测: A唾液中可能有远缘链球菌≥106~<108CFU/L唾液,变链菌≥108CFU/L唾液;B唾液中可能有远缘链球菌≥108CFU/L唾液,变链菌≤106CFU/L唾液;C唾液中可能有变链菌、远缘链球菌≥108CFU/L唾液。

讨论

唾液中致龋微生物的水平与混合菌斑中的水平呈正相关,可作为评价龋病易感性的指数之一,且唾液具有容易获得、易于定量、不受刷牙等环境影响而改变其致龋微生物水平等