摘 要：蛋白质组学是后基因组时代研究中兴起还不到十年的新型学科,但已应用到生命科学与基础医学研究中的各个领域. 对蛋白质组进行大规模的分析可使我们更加深入了解生物体的结构与功能. 在神经科学研究领域,对于神经突触、受体复合物以及其他的神经元和神经胶质特性的研究因为该学科的渗透,近年来取得了辉煌成就. 然而,蛋白质组学相关技术用于神经系统的研究还面临着很多挑战,如脑蛋白样品的准备、脑的复杂性、有限的数据库资源和生物信息学工具等. 蛋白质组学技术与其他功能基因组学研究方法,如基因芯片、网络生物学分析技术等相结合,将在基因及其功能、神经生理学与病理学之间架起一道重要的桥梁.
蛋白质组是指基因组表达的全部蛋白质的集合,蛋白质组学即是用来研究蛋白质组的学科[1 ] . 该学科最初主要是用来分析不同组织来源和生理、病理条件下蛋白样品的差异表达情况以及差异蛋白的鉴定,但如今更加倾向用于大规模的解析和揭示蛋白质的结构和功能. 对于蛋白质组的分析要比基因组困难的多,例如,蛋白质肽链就有多达20 种天然氨基酸组成,而基因组的基本组分只有A、T、G、C 四种碱基;蛋白质组是动态变化的,特定细胞中蛋白质浓度和组分呈现时空特异性的变化. 更为特别的是,蛋白质分子不能象EINA 那样可在体外条件下进行循环式的聚合酶链式反应(PCR) 扩增,因此分析过程中对量的需求就凸现出来.蛋白质组学就研究对象与目的不同可分为两个子学科,即表达蛋白质组学和功能蛋白质组学. 前者主要用于生物体、组织或细胞整体蛋白质组表达模式的描述,包括细胞器蛋白质组表达谱的分析和不同细胞来源,以及相同细胞不同病理、生理条件下蛋白质表达谱的差示分析等. 而功能蛋白组学则侧重于蛋白活性、蛋白质相互作用及翻译后修饰的研究[1 ] .
本文将重点讨论这两个子学科相关的技术,以及它们相互协作用于神经科学的研究.大规模的蛋白质组研究在酵母中已有很多报道,但在多细胞生物和神经科学领域才暂露头角. 酵母中,系统的蛋白质相互作用、蛋白质复合物的组成、亚细胞定位和翻译后修饰的研究都有报道[2 ] ;但相比之下,对于神经元和神经胶质蛋白质组分和动态的变化却知之甚少,目前相关的研究主要集中在亚细胞水平,包括神经传递素、粘连蛋白复合物、突触和轴突处蛋白组分的分析[3～12 ] . 不过,神经系统的蛋白质组学研究已愈来愈受到国内外同行的瞩目,从近年来由各国政府和科研机构共同发起的人脑蛋白质组计划可以看出. 蛋自质组学同时被用于研究神经和精神方面的疾病,但这也受限于不能从病人活体中取脑和相应的神经组织[13～26 ]
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1 蛋白质组学相关的核心技术由于蛋白质种类的多样性和蛋白质组的复杂性,如今涌现的许多蛋白质组学相关技术都是在生物、化学和各种分析手段整合的基础上发展起来的重组蛋白的生成,细胞组分的富集和生物化学纯化技术对于当今蛋白质组学的发展贡献极大. 目前,蛋白质组学技术平台主要包括与质谱(MS) 相结合的蛋白质分离系统,以及蛋白质芯片技术[27 ] .
它们之间可以优势互补,同时更倾向联合运用于生命科学与基础医学的研究.质谱的灵敏度和功能的多样性如今在蛋白质的鉴定中愈来愈受重视. 它可进行蛋白质的从头测序,翻译后修饰的分析以及定量测定. 步骤主要包括从特定的生物样品提取蛋白质组分,经过细致高效的分离得到单一的蛋白质条带(SDS2PAGE) 或蛋白点(22DE) ,用位点特异的蛋白酶(通常是胰蛋白酶) 进行酶切之后得到短肽混合物直接进行质谱分析或LC 分离后进行单一肽段测序,然后结合相关的生物信息学软件和数据库即可进行蛋白质鉴定(图1)
蛋白质组学中常用的方法是通过质谱获得目的蛋白的肽质量指纹谱和肽序列标签,然后结合相应的数据库和分析软件使目的蛋白得到鉴定[27 ] .
质谱与强大的蛋白质分离技术———双向电泳(22DE) 相结合是目前最成熟的蛋白质组学研究平台,目前已广泛应用于神经科学领域蛋白质表达谱和蛋白质组表达差异的分析. 然而,双向电泳技术本身也存在着局限性,如膜蛋白、极酸或极碱性蛋白、分子量特大或特小的蛋白都不能得到有效的分离,因此,几种可以替代和弥补双向电泳不足的技术随之出现,特别是基于高效的毛细管分离技术,如液相色谱(LC) 和反相色谱[28 ] .
后者可以将分离的蛋白直接送入质谱进行分析.
近两年,多维液相色谱与质谱相结合形成了一个非凝胶依赖的技术系统(LCPLC2MS/MS) ,深受科研工作者的欢迎,已被用于复杂蛋白复合物的分离与鉴定. 另一种非凝胶依赖的技术对于差异蛋白质组表达谱的研究作用极大,该技术结合了亲和层析捕获和同位素标记策略,可以减低蛋白样品的复杂性并对蛋白质组分变化进行定量分析.
这种同位素编码的亲和标记( ICAT) 策略已越来越广泛的用于神经科学领域的研究[29 ] . 尽管这些技术突飞猛进,对低丰度蛋白和蛋白质一级结构,即序列信息的全面分析还面临着严峻挑战.蛋白质芯片是将蛋白分子或多肽高密度地点到玻璃或硅材料表面,既可用于表达蛋白质组学研究,又可用于功能蛋白质组学研究[30 ] .
传统的用于蛋白表达检测的蛋白质印迹和酶联免疫吸附技术可被抗体芯片所代替,可在只有少量样品的情况下大规模检测蛋白表达谱的变化. 简单说来,该技术是将能够特异识别特定蛋白的抗体点到同一芯片上,然后与细胞、组织或体液的蛋白抽提物孵育,从而高通量检测蛋白质组分的变化,或蛋白质相互作用以及翻译后修饰的改变. 近来, Gembitsky 等运用该技术检测了人细胞系应对外界信号刺激的信号传导通路相关蛋白因子的酪氨酸残基的磷酸化修饰的变化,并期望在神经信号传导研究中发挥该技术的特殊优势[31 ] .
蛋白质芯片的另一亚类为功能蛋白质芯片,该技术平台可广泛用于检测蛋白质与脂类分子、核酸、小分子类物质以及与其他蛋白分子之间的相互作用[30 ] ,最近这项技术平台已有用于肿瘤发生和神经信号传导研究的报道[32 ,33 ] .蛋白质芯片研究策略的发展得益于全基因组测序计划完成的结果,从而将各个基因的开放阅读框(ORF) 导入一定的重组表达系统并获得大量目的蛋白用于芯片的制作. 另外,合成的多肽也可用于芯片的制作,已有文献报道用这类芯片研究蛋白质磷酸化修饰状况和蛋白质相互作用[34 ] .
与芯片上对应蛋白有相互作用的蛋白质可直接用于质谱分析. 然而,目前蛋白质芯片还没有全面用于神经科学的研究,但正朝这个方向迈进.2 神经科学中表达蛋白质组学研究神经系统中很多重要的蛋白质组分的研究已有报道[7 ,13 - 26 ,35 ] . 例如,运用双向电泳技术已分离了小鼠脑组织中的8 500 个蛋白组分,其中500 个已得到质谱鉴定[3 ] . 另一研究中鉴定了人幼脑中大约1 700个蛋白组分,对应437 个基因[32 ] . 另外,脑脊液、各种培养的神经元细胞系和脑不同区域蛋白质组表达谱也得到了研究[7 ] . 尽管这些研究中,蛋白质检测主要是通过染色、免疫检测和放射性标记,近年来也出现了其他的检测方法,如化学探针等.有目的地降低蛋白质组的复杂性和增加蛋白检测的动态范围,特别是细胞组分的富集和依赖于蛋白质化学和物理性质的分离,对于神经科学中蛋白质组表达谱的全面研究非常有用[13 - 26 ] .
细胞器蛋白质组表达谱的研究进展促使了脑蛋白质组的研究开始向线粒体、微体、胞浆和细胞质膜蛋白质组等特定的亚细胞组分的分析方向发展,如突触小体、突触膜、突触小泡和突触后富集区都已成为蛋白质组学研究中的目标组分[10 - 13 ] . 最近,基于质谱和非凝胶依赖的技术的发展,在这些组分中已鉴定了成千上百个蛋白,其中许多是已知的突触蛋白,但也有很多新的未知蛋白. 差异的蛋白质组表达谱的分析已用于脑不同区域和不同生理和发育状态下同一区域蛋白表达谱的动态变化研究[14 - 18 ] ;同时还用于病理学相关的神经退行性病、神经分裂症、脑损伤、中风和神经系统肿瘤发生的蛋白表达差异研究[26 ] .
为了寻找脑疾病诊断和预后症状的标志物,许多研究报道了脑脊液、星形胶质细胞分泌物和脑的微量透析物表达蛋白质组学分析[7 ,19 ,20 ] . 值得一提的是,新近发展的差异凝胶电泳技术(DIGE) 非常有助于这方面的研究,该技术的特点是将各个样品分别用不同的荧光染料进行标记,然后混合起来进行双向电泳分离,该方法已被用于寻找衰老相关蛋白的研究[33 ] .液相色谱与质谱相结合越来越成为一种很常规的蛋白质组学研究的方法,该方法结合同位素标记亲和标签技术已在很多神经蛋白质组学研究中得到运用,特别是对取自前脑和后脑的细胞质膜蛋白组差异分析极为有效[9 - 11 ] .
例如,Che 等用该方法对野生型和突变型小鼠脑垂体抽提物神经肽的表达进行了差示分析,获得
