植物PHGPX为研究对象，运用Southern杂交以及PCR法对十种常见植物进行PHGPX基因的筛查

植物PHGPX为研究对象，运用Southern杂交以及PCR法对十种常见植物进行PHGPX基因的筛查 中文摘要 高浓度的活性氧会对生物体造成严重的损害。谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶（PHGPX）是已知的唯一能直接还原膜上磷脂氢过氧化物从而保护生物膜免受过氧化损伤的酶，具有重要的研究价值。 本研究以植物PHGPX为研究对象，运用Southern杂交以及PCR法对十种常见植物进行了PHGPX基因的筛查，发现在九种植物中均存在PHGPX条带，进而运用RACE-PCR技术分别从水稻、萝卜和苦瓜中克隆到了完整的PHGPX cDNA，计算机检索显示这是三个新基因，分别编码169、197和167个氨基酸的蛋白。对推测氨基酸序列进行各种特征分析比较和功能预测后发现，水稻、萝卜和苦瓜PHGPX均完整保留有PHGPX的三个特征结构域，与动物PHGPX最大的区别在于催化残基都是半胱氨酸，并非硒代半胱氨酸，暗示出PHGPX在植物和动物抗氧化体系中所起的作用可能有所不同。这三种植物PHGPX与其他动植物PHGPX在二级结构组成和三级结构某些方面的相似性高于一级结构上的同源性，说明对酶活性和功能而言，空间结构比一级结构更为重要。这三种植物PHGPX催化残基周围的疏水性残基形成一个疏水区，利于磷脂氢过氧化物等脂溶性的底物与催化残基相接触，这一结构特征与其潜在的功能相适应。此外，预测结果还表明水稻和萝卜PHGPX具有不同的细胞定位：水稻PHGPX可能是膜结合蛋白；萝卜PHGPX由于N端含有线粒体基质定位信号，很可能定位于线粒体基质中，说明PHGPX在植物中有多种同功型。 对水稻PHGPX的表达特征分析和抗氧化活性测定结果表明，水稻PHGPX基因是单拷贝基因，该基因的转录水平在成熟植株的旗叶中最高，其次为幼苗和成熟植株的茎；在成熟植株中，PHGPX在绿叶、尤其是旗叶中含量较高，其他部位则几乎检测不到该蛋白，说明水稻PHGPX的表达在mRNA和蛋白质两个水平上都具有明显的组织特异性，该表达特征恰好符合水稻植株内部活性氧的分布规律。另一方面，各种氧化胁迫条件能显著诱导该基因转录水平上升，表明PHGPX与植株对环境胁迫刺激的应答反应有关，可能具有缓解植株体内氧化胁迫的作用。水稻PHGPX在大肠杆菌中获得了高水平的表达，重组蛋白的实际分子量略大于理论值，说明可能存在蛋白质翻译后修饰反应。在含有一定浓度过氧化氢的培养基中，表达水稻PHGPX的重组菌的存活率明显高于对照，证明水稻PHGPX具有抗氧化功能。 上述结果为本室正在进行的高效表达PHGPX的重组水稻的构建以及植物PHGPX的结构与功能的研究奠定了基础。 关键词：谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶，植物，分子克隆，表达特征，抗氧化活性