关键词:亲子鉴定 亲子鉴定/试剂盒 重复序列 短串联
短串联重复序列(short tandem repeats,STR)中以3、4个核苷酸为单位的STR,因其含量大、且具有高度多态性而被作为遗传标记,用于人类遗传学、法医学研究,为基因定位、基因诊断、亲子鉴定、个体识别和性别鉴定提供了有力的手段[1]。笔者应用Identifiler Plus Kit和Profiler Plus Kit对1例特殊亲子关系案例进行鉴定,探讨应用IdentifilerPlus Kit鉴定亲子关系的必要性。
1 材料与方法
1.1 样本来源 1份亲子鉴定样本,汉族,为父子二联体。
1.2 试剂与仪器 DNA提取试剂为Chelex-100(Sigma公司);亲子鉴定试剂盒为Identifiler Plus Kit(美国ABI公司)16位点。Profiler Plus Kit(美国ABI公司) 9位点。PE-9600扩增仪(美国PE公司);ABI-310基因分析仪(美国ABI公司)。
1·3 DNA提取 采用Chelex-100方法[2]抽提基因组DNA。
1·4 STR基因检测 采用Identifiler Plus Kit,扩增位点为D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1,D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX,D18S51,D5S818,FGA和Amelogenin性别位点。采用Pro-filer Plus Kit,扩增位点为D3S1358,VWA,FGA,D8S1179,D21S11,Dhttp://www.51lunwen.org/fayixue/18S51,D5S818,D13S317,D7S820和Amelogenin性别位点。4μl反应混合液,1μl Gold Taq酶(5U/μl),引物2μl,DNA(1-2.5ng)2μl,总体积为10μl。PCR循环条件为:
95℃11min;94℃1min,59℃1min,72℃1min,共28个循环;60℃45min。
1.5 扩增产物检测分析 甲酰胺10μl,GS-500(ROX) 1μl,PCR产物/Ladder 1. 5/1. 5μl, 95℃变性5min,迅速冷却5min。采用美国ABI公司Data Collection Software V2.1,GeneScan Software V3.1.2, Genotyper Software V2.5.2软件。
2 结果
2.1 采用Identifiler Plus Kit扩增16个STR基因座位,采用Profiler Plus Kit扩增9个基因座位,结果见表1。9个位点的试剂盒检测的结果中只有一个位点D13S317不相合,其它的8个位点完全相合。由于只有1个位点的不同,所以又追加了16个位点的试剂盒,16个位点中有3个位点不相合,其余13位点相合。
表1 2个试剂盒对同一案例进行鉴定的结果
3 讨论
目前亲子鉴定的首选方法PCR-STR检验是美国食品药品管理局(FDA)唯一认证用于亲子鉴定的DNA检测方法。正常情况下进行三联体亲子鉴定。在实际工作中经常遇到父子组合二联体的亲子鉴定,其原因可能是父亲不想让母亲知道,母亲不配合或节约费用等。由于缺失母亲,二联体的亲子鉴定有其特殊性。客观的处理方法是将母亲提供给孩子的必需等位基因机会按随机个体对待;当孩子为杂合子时,把生母的基因型按与孩子相同的基因型对待。
利用DNA-STR进行亲子鉴定时,通常情况下,当孩子的等位基因中出现1个陌生的等位基因时,不影响认定的结果,2个(包括两个)以上时则应更换引物、探针,重新检验,如果还为2个以上不同时,则应否定亲子关系。孩子DNA检测的等位基因中有3个以上陌生的等位基因时,则肯定排除亲子关系。由于STR位点突变率较高,故不能根据1个STR位点的检测结果不同而否定亲子关系。本文用两种不同的试剂盒对同一案例进行鉴定。从该案例中不难发现,9个位点试剂盒存在着对判定结果不稳妥的因素。根据本试验的结果,如果只采用9个位点试剂盒检测时,只有1个位点不同,不能得出排除的结果,一个位点的不同有可能是基因突变的结果,也可能就是遗传了不同的等位基因。亲子鉴定必须有100%的把握,否则将会带来不可估量的影响。因此,对于亲子鉴定来说,使用16个位点的试剂盒是非常必要的,这一点必须引起高度注意。
参考文献
1 Edwards A , Civitello A , Hammond AH , et al. DNA typingand genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem re-peats. Am J Hum Genet, 1991,49(3):746
2 Walsh PS , Metzgar DA, Higuchi R. Chelex-100 as a mediumfor simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensicmaterial. Biotechniques, 1991,10:506
3 柳 燕,何根兰,李 莉,等.复合扩增9个STR位点在亲子鉴定中的应用评估.中国法医学杂志, 2000,16(4):2164 刘开会,李宗亮.实用法医DNA检验学·西安出版社,2000,38
