RF对纳米金标记的RNase-S局部加热效应的研究
提 要:目的 在纳米级或微米级结构的线度可以和热辐射波长λ相比拟的状态下的辐射热传导的研究具有重要的实用意义,通过建立生物模型来研究射频电磁辐射医学论文网(RF)对纳米结构辐射热传导的特征,并探讨微波非热效应的可能作用机制。方法 将制备的纳米金标记的RNase-S样品通过常规的Poly-C水解能力的测定及CD谱的测定分析,确定酶的2级结构的重组成功和活性的存在后,比较RF对样品、水和空气的热效应。结果 通过紫外分光光度计对制备的纳米金标记的RNase-S样品的Poly-C水解能力的测定及谱的测定,表明研究中使用的生物模型和RNase A模拟得十分满意。空气浴中的封装空气样品的散热曲线呈现指数衰减规律,而空气样品的加热过程呈指数增加趋势。空气浴中的双蒸馏水样品的加热过程基本上是线性增加。但是,水浴的纳米金标记的RNase-S样品的加热过程却基本上保持恒定值。结论 RF辐射在实验的条件下会由于被加热介质的不同热物理性质表现为不同的加热效果,对于含有纳米金属的微结构,可能会在局部产生微涡流发热。以纳米颗粒为热源的辐射热传导可能会和生物大分子的结构调整发生谐振从而不表现出样品整体宏观的升温。生物功能性大分子关键部位局部加热的谐振吸收是微波等物理因素的非热生物效应的可能作用机制。
关键词:纳米结构;射频;局部加热作用;核糖核酸酶修饰物
ALocal thermal effect of RF on nanogold-labeled RNase
Abstract:Objective To establish a biological modelwith nanostructure and to investigate the characteristics ofthe thermal conduction by radio-frequency electromagnetic radiation upon the model for the exploration of the possiblemechanismof microwave non-thermal effect.Methods The prepared nanogold-labeled RNase-S sample was ana-lyzed byroutine hydrolytic abilityof poly-c and CDspectroscopy. After confirmation ofthe successful recombination ofthe enzymatic structure and the recovery of the enzyme activity, thermal effects of RF on the sample, water and airwere compared.Results The biological model designed and prepared byus satisfactorilysimulated the native RNaseA in both recovery of enzyme activity and conformation. Air sample in air bathing possessed an exponent decreasingfunction forthermal dispersion and an exponent increasingfunction forRFthermal effect. The redistilledwatersamplehad a linear increasing function for RF thermal effect. Meanwhile, nanogold-labeled RNase-S in water bathing keptconstant for RF thermal effect.Conclusion Micro-eddy current local heating might occur in microstructure consist-ing of nanometal cluster. A biological macromolecule with nanostructure, acting as a source of thermal radiation andconduction, might resonantly interactwith some changeable domains nearby, so the biological model keeps isothermalduring RF heating. This may be a possible mechanismof nonthermal effect for microwave and other physical factors.
Key words: nanostructure; RF; local heating; modified RNase
在纳米级或微米级结构的线度可以和热辐射波长λ相比拟的状态下的辐射热传导的研究具有重要的实用意义。Mulet Jean-Philippe等[1]的研究表明,对纳米结构的加热作用具有局部性;此外,由于渐消波对能量交换的贡献,纳米颗粒向间距在纳米级的半导体材料表面的辐射热传导的波长几乎是单色的,而且在大小上可以加强若干个数量级。本实验研究旨在建立一种人工纳米微结构来探讨电磁辐射对生物大分子热效应的可能作用机制。RNase A是一种重要的生理功能酶;它可以方便地在第20~21残基之间分开成2部分:分子量较小的短肽S-Peptide和剩余部分S-Protein,并能重新组装成活性完全复活的RNase-S,而成为研究蛋白质折叠的适宜模拟物[2]。Nanogold 是一种新近研制的分散状态纳米金标记物,可以较容易地标记在任何含有巯基的抗原或生物大分子上。于是,我们利用纳米金标记物Nanogold 先和含巯基的S-Peptide替代物S-18短肽结合,再和S-Protein合成为修饰的RNase-S作为纳米级结构的辐射热传导的生物模型,进行了生物纳米结构辐射热传导机制的实验研究。
1 材料和方法
1.1 材料设计 我们设计了S-18短肽,其氨基酸序列为n-CGGKETA-AAKFERQHMDS-c,除CGG外,其它部分保留了S-Peptide的功能序列。设计加入的1个含巯基的半胱氨酸C是为了和Nanogold共价结合;2个甘氨酸GG充作间隔基团,以避免半胱氨酸C结合纳米金后可能发生的结构障碍。
1•2 样品制备 合成的S-18肽样品已经过高效液相色谱(HPLC)纯化并通过质谱鉴定。固体纳米金试剂先按0.3μmol/L的浓度溶于异丙醇,再加去氧、去离子水稀释到1 ml制成溶液,直接在溶液中加入150 nmol/L的S-18纯肽,振荡均匀混合后在4℃的冰箱中放置过夜。充分发生反应的溶液系统经Sephadex G-25过柱,收集标记了纳米金的肽S-18;再在缓冲液(pH6.0)中与S-蛋白在室温下组装成纳米金标记的RNase-S。S-18由Alpha Diagnostic公司(SanAntonio, TX, USA)合成,纳米金试剂由Nanoprobe公司(Yaphank,NY)提供,S蛋白为Novagen公司(Madison, WI)的产品。
1•3 生物模型鉴定 将制备的纳米金标记的RNase-S样品先通过常规的Poly-(C)水解能力的测定鉴定活性大小,在确保酶活性的恢复大于95%之后,再通过CD谱的测定分析,确定纳米金标记的生物样品RNase-SU二级结构的重组成功。使用的CD谱仪为AVIV62DS型。
1•4 对样品进行电磁耦合加热作用测试的仪器和装置 自行设计并在塑料骨架上绕制一只空心耦合线圈,线圈的线匝密度疏密得当,既保证螺旋线圈内场的均匀性又利于热交换,并且通过对塑料骨架尺寸和漆包线参数的选择最后使得耦合线圈与射频信号发生器(工作频率为1 GHz,输出功率范围为0.4~4 W)的输出阻抗匹配。信号以等时间间隔的方脉冲形式输入线圈,可以无惰性地给耦合线圈空腔内的媒质或者样品加热。实验所使用的多种信号发生器型号为Hewlett Packard8646C型,由Hp公司生产。
1•5 RF对纳米金标记RNase-S加热效应的测定 将装有纳米金标记的RNase S样品(1.5 ml)的薄壁且密封性很好的PCR试管放入线圈中。试管管盖钻小孔,针型热电偶探头插在样品中部。将耦合线圈连同样品等浸入37℃的水浴中。在1.4说明的方式下RF作用8 min,每间隔1 min测量样品的温度改变。测量温度变化的热电偶温度计型号是OmegaCSC32,系Omega公司的产品。
1•6 对比实验 为验证纳米颗粒传热的局部增强特征,我们在同样的RF加热条件下,在PCR测试管中封装和环境温度平衡的空气或双蒸水浸在空气浴(空气保持稳定,环境温度维持在变化幅度不大于0.5℃的实验空间)中重复同样的实验。
1•7 空气浴封装空气样品的散热曲线测定 做出在上述实验的条件下封装的空气样品浸在空气浴中的散热曲线,以便分析比较。
2 结果
2.1 纳米标记的RNase S二级结构的CD谱的测定 通过紫外分光光度计对制备的纳米金标记的RNase S样品的P
