本文是一篇药学论文，本篇论文中，主要采用硫酸乙酰肝素类似物刺激肿瘤细胞获得衍生的外泌体，再将获得的不同来源的外泌体加入到肿瘤细胞中，探讨硫酸乙酰肝素类似物对外泌体生成以及功能方面的影响。得到了如下结论： 1.通过对硫酸乙酰肝素衍生物的制备和表征成功制备了 6-O-DeSH的产物，通过FT-IR、NMR、GPC-MALLS等方法进行了结构的表征，明析了硫酸乙酰肝素类似物主要结构。
第一章 绪论
1.1 引言
硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）是一个由重复二糖单元构成的线性多糖，该二糖单元与各种核心蛋白共价连接以生成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan sulfate proteoglycan，HSPG）[1]。HSPGs 存在于迄今研究的所有动物细胞的质膜上，是细胞外基质的主要成分，在发育和正常生理中的发挥着重要的作用。硫酸乙酰肝素链与蛋白质配体的静电相互作用，影响所有器官系统的代谢、运输、信息传递、支持和调节，由此可见，HS 在许多生理和病理过程中扮演着重要角色[2]。尤其是在肿瘤的发生和发展过程中，参与肿瘤的生长和转移。其主要原因是由于 HS 的结构决定了生物学功能的基础，主要的结构表现就是硫酸化结构位点的改变、分子量的大小改变等方面。HS 与蛋白质的相互作用从一定程度上决定了 HS 的功能[3]。在癌症中，介于 HS 的结构特性，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的 HS 参与肿瘤的生长和转移，糖类硫酸化的总体模式已被发现与肿瘤发展中多种促肿瘤原性因子的调节和细胞信号传导相关[3]。此外，最近在肿瘤微环境的研究中外泌体越来越受到关注，外泌体的发生和分泌是一个复杂的生物学过程。研究发现 HS 在这一过程中发挥着重要的作用，但是其中的构效关系尚未明确，因此，明确 HS 糖链结构与外泌体的生物合成及分泌之间的构效关系将会对肿瘤微环境的调控起到至关重要的作用。
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1.2 硫酸乙酰肝素
1.2.1 硫酸乙酰肝素的结构及功能
HS 是一类高度硫酸化的线性多糖[3]，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）的一部分。重复的二糖单元中，一个单糖是氨基葡萄糖残基，另一个是糖醛酸[4]。硫酸乙酰肝素的主要二糖单元如图 1-1 所示，主要为葡萄糖醛酸（GlcUA）以及艾杜糖醛酸（IdoUA）的结构[5]。
![图 1-1 硫酸乙酰肝素主要重复二糖单位[5]](http://static.51lunwenwang.com/image/2021/1102/20211102142263436343.png "图 1-1 硫酸乙酰肝素主要重复二糖单位[5]")
图 1-1 硫酸乙酰肝素主要重复二糖单位
HS 的生物合成过程是在一个细胞高尔基体内进行的，受到严格调控的多步酶促反 应，N-脱乙酰化和 N-硫酸化是所有后续酶法修饰的初始条件，其次是葡萄糖醛酸转化为艾杜糖醛酸，由 C-5 差向异构酶催化，不同位点的硫酸化使得 HS 的结构与功能具备了多样性的特点[6]。多糖糖链要经过许多修改，这些修饰涉及氨基葡萄糖的去乙酰化和硫酸化、GlcA 向 IdoA 差向异构化、己糖糖醛酸（通常为 IdoA）的 2-O-硫酸化、氨基葡萄糖的 6-O-硫酸化和 3-O-硫酸化[6]。它们从除去乙酰基开始，然后被硫酸盐取代，后一个过程是由 N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶（NDST）的酶复合物催化的。
在 HS 的生物合成方面，HS 生物合成中的聚合物修饰反应，反应的顺序由底物特异性决定，可能还受 GAGosome（B 组）中酶的拓扑结构的影响，目前所有已知的 HSPG的多糖链都是按照相同的机制产生的[7]。如图 1-2 所示，该过程发生在高尔基体中，包括一系列初始糖基化反应，产生与核心蛋白丝氨酸残基共价结合的四糖。通过下一个糖基化步骤确定要形成的 GAG 链的类型，这将在连接序列的非还原末端 GLcA 单元中添加 β-1，4-连接的 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）或 α-1，4-连接的 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）残基。该步骤分别选择产生 CS/DS-或者是 HS/肝素糖链的过程，GlcNAc取代后由交替的 GlcA 和 GlcNAc 残基聚合，得到了一种 HS 前体多糖。合成的聚合物通过一系列复杂的反应进行改性，包括 GlcNAc 残基的 N-脱乙酰化/N-硫酸化，GlcA 的C5-异构化为艾杜糖酸（IdoA）单元，以及 C2 位的己糖醛酸和 C3 和 C6 位的氨基葡萄糖（GlcN）残基的 O-硫酸化[8]。
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第二章 硫酸乙酰肝素类似物的制备与表征
2.1 引言
肝素作为硫酸乙酰肝素类似物的一种典型代表，同时也是糖胺聚糖类药物，由于其具有抗凝血特性而被广泛地应用于临床治疗。近年来，肝素除抗凝之外的生物功能越来越受到人们的关注，因此，对肝素的结构修饰改造受到了广泛的关注。研究表明，通过化学反应或者酶解反应，可以降低肝素结构中的硫酸基团含量，同时去除肝素结构中能诱发抗凝活性的某些特定寡糖序列。由于肝素构效关系的复杂性，导致不同来源、不同制备方法得到的肝素衍生物结构特异性不尽相同。结构是肝素衍生物活性的基础，因此不同种类的肝素衍生物在生物学活性上也存在着显著的差异，相互之间存在着不可替代性。
本章采用了化学衍生化制备了 6-去硫酸化的肝素。采用傅里叶红外光谱法、核磁测定、元素分析和电位测定等方法来进行制备产物的表征，进一步明确去硫酸化肝素的结构。
对肝素和制备获得的样品6-O-DeSH进行FT-IR光谱检测，以确定产物的化学基团变化，结果如图2-3所示。通过FI-IR光谱在肝素的FT-IR光谱中观察到多糖在3424 cm-1和2939 cm-1处的特征吸收峰，分别归属于O-H和C-H的拉伸振动。与肝素相比，6-O-DeSH在1226 cm-1处的吸收峰减弱，归属于O-SO3的S=O拉伸振动的特征信号强度。与此同时，与C-O-SO3基团的C-O-S振动有关的805 cm-1处的吸收峰减弱，表明6-O-DeSH的6-O硫酸化基团成功去除。通过初步结果可以判定经过系统的脱硫反应，得到了一组选择性脱硫的肝素衍生物，为后续的实验进行提供了去硫酸化的肝素产物。
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2.2 实验材料
2.2.1 实验试剂及药品
使用的主要试剂及药品如下：
表 2-1 实验试剂
称取 30 g 交换树脂（732 阳离子），加入适量超纯水置于摇床中，150 rpm/min 清洗3 h，中间更换三次去离子水。然后用 4 %-5 %的 HCl 和 NaOH 依次清洗，每次酸碱的用量约为树脂体积的两倍，活化树脂。用去离子水将树脂洗至中性待用。将 10 g 肝素钠溶于 80 mL 去离子水中，4 ℃预冷。然后向其中加入树脂，溶液在摇床上以 150 rpm/min 的恒定速度在 37 ℃摇动过夜。收集上清液，将树脂洗至中性，得到的总体积约 500 mL。置于冰上，加入约 6 mL 的无水吡啶，将 pH 值调节至 6.0-7.0。充分透析后，将上清液冷冻干燥以获得肝素吡啶盐。
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第三章 硫酸乙酰肝素类似物对肿瘤外泌体生成的影响 ....................... 22
3.1 引言 ........................................ 22
3.2 实验材料 .......................................... 22
3.2.1 实验药物 ............................... 22
3.2.2 实验试剂 ............................... 22
第四章 硫酸乙酰肝素类似物对肿瘤外泌体功能的影响 ......................... 35
4.1 引言 ................................ 35
4.2 实验材料 .................................. 35
4.2.1 实验药物 .................................. 35
4.2.2 实验试剂 ...................... 35
主要结论与展望 ............................... 44
主要结论 ............................ 44
展望 ............................... 44
第四章 硫酸乙酰肝素类似物对肿瘤外泌体功能的影响
4.1 引言
肿瘤来源的外泌体由于其本身的特点和功能，在肿瘤微环境中的作用不可忽视。在肿瘤治疗广受关注的今天，外泌体的靶向治疗，成为了一个临床治疗的新思路。例如：靶向干扰外泌体的合成和分泌，对其信号传导进行一定干扰，都成为了研究的热点。
外泌体在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色。在肿瘤的发生发展过程中，外泌体影响着肿瘤的增殖、迁移、侵袭等功能。本研究从不同结构的硫酸乙酰肝素类似物出发，通过调控不同的硫酸乙酰肝素类似物分子量的大小、以及硫酸化位点的修饰，研究其对外泌体功能的影响。在硫酸乙酰肝素类似物对外泌体机制的影响上进行了初步的探索，为进一步探究其在肿瘤发生发展过程中所发挥的作用以及肿瘤的机制研究探寻提供了新的思路。
本章实验所使用到的主要试剂如
