本文是一篇药学论文，本研究对积雪草不同组分进行初步的体外抗氧化活性初筛，并成功将其应用到 HaCaT 细胞炎症模型上，通过检测细胞内氧化应激水平、炎症因子和皮肤屏障相关因子基因表达情况探究其对 HaCaT 细胞的保护作用，并进一步考察了其对 HaCaT 细胞凋亡水平和炎症通路相关蛋白的调节作用。最后，通过动物实验证明积雪草乙酸乙酯组分能够改善咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠病症，为积雪草组分的应用提供了实验依据。
第一章 绪论
1.1 银屑病
银屑病是一种由遗传和环境等因素共同诱发的慢性炎症性皮肤疾病，病因与发病机制尚未明确，主要以角质形成细胞过度增殖及免疫细胞在真皮及表皮的炎症浸润为主要病理生理学特征[1]。近年来，全球范围内银屑病患病率日益上升，影响了近 2-3% 人群[2]。银屑病患者承担着巨大的生理压力，皮肤瘙痒疼痛，甚至破裂出血，严重者不能自由活动。此外，心理上也饱受煎熬，影响正常社交，生活质量下降。由于银屑病发病病程比较长久，并伴随着一系列并发症，目前的药物很难完全治愈银屑病，因此迫切需要对此类疾病进行预防与治疗，并寻找更加理想的药物[3,4]。
当代对于银屑病的研究主要集中在免疫系统失衡、慢性新血管生成以及表皮细胞过度增殖等方面[5]。根据全基因组关联研究（Genome wide association studies，GWASs）证实，固有免疫和适应性免疫反应紊乱是银屑病炎症发生和持续存在的主要原因[6]。到目前为止，已经证实肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素 23（Interleukin 23，IL-23）/辅助性 T 细胞 17（T helper cell 17，Th17）介导的相关途径在银屑病的发病机制中处于关键地位。在银屑病皮损部位，IL-23 分泌增加，进一步刺激 Th17 细胞分泌大量细胞因子，如白介素-17A（Interleukin 17A，IL-17A）、IL-17F（Interleukin 17F）、IL-22（Interleukin 22）等，这些细胞因子通过作用于角质形成细胞，诱导其过度增殖。同时当角质形成细胞活化后，可分泌出大量的炎症因子、趋化因子、抗菌肽等，这些因子会进一步浸润免疫细胞[2,7]。其他免疫相关细胞，如辅助性 T 淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞也可以通过产生 IL-17A 或者其他机制对 Th17 细胞功能进行调控，这些结果都试图阐明以 IL-17A 为中心的发病机制。
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1.2 银屑病发病机制
细胞信号通路是指细胞通过细胞膜或细胞内的受体感受信息分子的刺激，继而通过产生各种免疫相关因子和炎症相关因子，对细胞代谢进行调控。在一些外来因素刺激下，皮肤中的抗原呈递细胞与抗原相结合，这些活化的抗原呈递细胞进一步激活某些细胞因子表达，这些细胞因子通过激活某些信号转导分子加剧炎症反应，进而使银屑病样皮损持续发生[21]。
1.2.1 银屑病与 NF-κB 通路
NF-κB 属于细胞内的一种初级转录因子，参与机体内多种生命活动，尤其是在免疫应答方面，且其活性在多个步骤中都受到严格调控[22]。正常情况下，NF-κB 与其抑制因子 IκB 相结合，处于非活化状态[23]。在某些外界因素刺激下，如（TNF-α、IL-1、IL-17、病毒和脂多糖），IκB 磷酸化并解离出来，此时 NF-κB 由细胞质进入细胞核内，与某些基因调控序列结合，对下游的分子进行调控[24,25]。NF-κB 对银屑病的影响不仅通过调动细胞内各种炎症因子、趋化因子、淋巴因子，还通过影响角质形成细胞的增殖与分化水平发挥作用[26-28]。研究表明，在银屑病患者皮损部位的内皮细胞中，NF-κB p65 染色明显增加，这表明活化的 NF-κB 水平与银屑病的病程息息相关[29]。
Janus 激酶（Janus kinase，JAK）对细胞因子介导的相关信号转导具有重要作用。迄今为止，4 种 JAK 亚型已被鉴定，即 JAK1、JAK2、JAK3 和酪氨酸激酶 2（TYK2）。当一些生长因子和细胞因子激活 JAK，JAK 激活后进一步导致信号转导及转录激活因子（Signaltransduction and activator of transcription，STAT）磷酸化，而 STAT 是一类 DNA 结合蛋白，能够结合下游靶基因进而调控细胞的增殖、凋亡和分化水平。STAT 共有 7 个家族成员，其中，STAT3 与银屑病的发生发展最为密切[33,34]。相关研究表明，与健康小鼠皮损组织相比，银屑病小鼠皮损组织中 STAT3 表达水平上调，且通过抑制 STAT3 信号通路相关因子表达能改善咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠病症[35]。
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第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
表 2-1 主要仪器与生产厂家
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2.2 实验方法
2.2.1 积雪草不同组分提取分离
取 40 g 干燥积雪草（由云南中医药大学俞捷教授鉴定并馈赠），粉碎，按料液比 1:15 加入 600 mL 60% 乙醇溶液，浸泡 15 h，40oC 超声 1 h，过滤，收集滤液，滤渣重复上述过程两次，合并滤液，旋蒸得小体积浓缩液，将浓缩液均分两份，一份冷冻干燥，得乙醇组分；另一份依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，合并萃取液，旋蒸得到小体积浓缩液，用少量二氯甲烷复溶正己烷、乙酸乙酯萃取物，挥干，得正己烷组分、乙酸乙酯组分；用少量去离子水复溶正丁醇、水相萃取物，冷冻干燥，得正丁醇组分、水相组分。将各种组分用 DMSO 溶液配制成 50 mg⸱mL-1 的母液备用，整个提取过程如图 2-1。
图 2-1 积雪草 5 种组分提取流程图
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第三章 结果与讨论 ....................................... 19
3.1 积雪草不同组分的提取率 ............................................. 19
3.2 积雪草不同组分总黄酮含量测定结果 .................................. 19
3.3 积雪草不同组分总多酚含量测定结果 ..................................... 19
主要结论与展望 ........................... 40
主要结论 ........................................... 43
展望 ..................................... 43
第三章 结果与讨论
3.1 积雪草不同组分的提取率
提取积雪草不同组分，提取率如表 3-1 所示，由表可知，积雪草不同组分的提取率为乙醇组分最高，水相组分、正丁醇组分次之，其后为乙酸乙酯组分，正己烷组分的提取率最低。
表 3-1 积雪草 5 种组分提取率
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主要结论与展望
主要结论
本研究对积雪草不同组分进行初步的体外抗氧化活性初筛，并成功将其应用到 HaCaT 细胞炎症模型上，通过检测细胞内氧化应激水平、炎症因子和皮肤屏障相关因子基因表达情况探究其对 HaCaT 细胞的保护作用，并进一步考察了其对 HaCaT 细胞凋亡水平和炎症通路相关蛋白的调节作用。最后，通过动物实验证明积雪草乙酸乙酯组分能够改善咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠病症，为积雪草组分的应用提供了实验依据。主要结论如下：
（1）积雪草不同组分的总黄酮和总多酚含量存在差异，乙酸乙酯组分所含总黄酮和总多酚含量最高，分别为 182.76 μg·mL-1 和 88.08 μg·mL-1，其次为正丁醇组分。体外抗氧化能力显示，积雪草正丁醇组分和乙酸乙酯组分的抗氧化能力明显优于其余组分。
（2）在&nb
