前言
1获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)
艾滋病（或称得到性免疫缺陷综合症，英文名称：Acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)是一种由人类免疫性缺陷病毒（又称艾滋病病毒，是一种熏染人类免疫体系细胞的慢病毒（Lentivirus)，英文名称：Humanimmunodeficiency virus, HIV)引起的一种后天性细胞免疫功效出现缺陷而导致严峻随机熏染及/或继发肿瘤并致命的一种疾病[1，2]。艾滋病的重要流传途径有三种：性流传、血液流传和母婴流传。此中性流传是最重要途径。别的，共用针头、毒品的静脉注射，和带有创伤性的医疗查抄，都有病毒交织熏染的大概。染上艾滋病病毒后，凭据病情生长历程，临床上分为三个时期：急性熏染、临床埋伏期和发病期。
自1981年美国发现了第一例艾滋病病人[3]至2013年，全球累计大约有7500万人被其感染，其中大约有3600万人死于AIDS或者AIDS相关疾病[4]。另外，2013年UNAIDS报告数据显示目前人患感染mV总数约3530万，其中90%以上的HIV感染者分布于不发达国家，尤其在撒哈拉以南非洲较为严重，占总感染人数的75%。此外，亚洲和东欧占总感染人数的22%，其余一小部分分布在美洲W (表前-1)。
我国艾滋病防治工作形式也很严峻，据中国卫生部、UNAIDS和WHO联合报告显示，自1985年报告第一例艾滋病病例感染者至2011年底，中国存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人78万，全人群感染率为0.058%，其中艾滋病病人15.4万[5]。2011年当年新发HIV感染者4.8万人，艾滋病相关死亡2.8万人。我国艾滋病流行具有以下特点[5]: (1)艾滋病疫情总体呈低流行态势，但部分地区疫情严重，在云南，广西，河南，四川，新疆和广东呈高流行趋势，报告人数占全国报告总数的75.8%。（2) HIV感染者和AIDS病人数量继续增加，但新发感染人数保持在较低水平。与2009年疫情估计结果相比，存活的HIV感染者和AIDS病人总数增加4万人，AIDS病人由2009年的10.55万上升为为2011年的15.4万，但新发HIV感染控制在较低水平，2007年为5.0万，2009和2011年均为4.8万。（3)传播途径以性传播为主，所占比例继续增高。2011年估计性传播比例达到了 63.9%，比2009年增加了 4.9%。（4)感染人群多样化，流行形势复杂化。
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2人类免疫性缺陷病毒（HIV)
人类免疫性缺陷病毒（mv)是一种熏染人类免疫体系细胞的慢病毒，属于逆转录病毒的一种。HIV病毒分为两种：HIV-1，HIV-2。HIV-1是此中较为流行的一种，分为M组群，0组群以及N组群（main group(M)； outlinergroup(O)； non-M, non-0 group(N)),其中 M 组又分为 A 到 K 的 11 个亚型(clades)，N组和0组则主要在非洲小范围流行。HIV-2分为A到F六组，它基本只存在于西部非洲部分地区。HIV-1的毒性与传染性均高于HIV-2。
HIV病毒颗粒直径约100-120 nM,呈二十面体。典型的HIV-l颗粒由核心和包膜两部分组成（图前-1)。病毒外膜是脂蛋白的包膜，来自宿主细胞，嵌有病毒的糖蛋白gpl20和gp41, gpl20是病毒表面抗原，为外膜糖蛋白。gp41是跨膜糖蛋白，gpl20与gp41通过非共价作用结合。病毒核心为锥形，核心蛋白p24组成的半锥形衣壳（Capsid)，内含病毒RNA基因组、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）等，HIV的RNA为两条相同的正股RNA链。基体蛋白pl7构成病毒外膜和病毒核心间的球形基质(Matrix)。
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第一章带有Q64和A67突变位点的HIV-1假病毒和T2635耐药病毒株对ADS-J1抗性研宄
在gp41分子结构中，NHR包含一个口袋区（pocket-forming domain，PFD)、一个七肽重复序列（heptad repeat, HR)和一个甘氨酸-异亮氨酸-缬氨酸基序（glycine-isoleucine-valine motif，GIV )。CHR 包含一个口袋结合区(pocket-binding domain，PBD )和一个七肽重复序列。其中，GIV基序(GIVQQQNNLL)决定着T-20的耐药性。研究表明，带有PBD的C肽C34、T2635、T1144和CP32M比不带有PBD的T-20具有更好的抑制HIV-1融合活性和耐抗性株。NHR和CHR含有多个4-3七残基疏水重复序列，其残基按顺序分别定义为a、b、c、d、e、f、g位，而每个NHR上的e、g位点可以结合CHR上的a、d位点形成6-HB[43]，研究发现这4个位点在病毒膜融合过程中起着决定性的作用[86，87]。另外的b、C、f位点是裸露的，有可能作为抗体、gp41结合蛋白，及一些抑制剂的结合位点，例如已报道的中和抗体bF-3674 Fab的结合位点都包含位于c、f位点的W60A和Q64。Yu和Lu已经构建了带有突变位点的HIV-1 Env突变体（图1-1)，并且实验结果表明，带有这两个突变点的假病毒对C34都产生了显著抗性，但对不含PBD的T-20却没有抗性。另外，Eggink_获得了一些带有多突变点的T2635耐药株，且一些突变位点位于gp41区域，但只有Q66 (图1-1)位于PBD区域。本章我们拟通过利用这些突变点位于gp41区域的抗性株对ADS-J1进行耐药性研宄，检测这些位于gp41区域的突变点是否对ADS-J1的活性有影响，从而证明ADS-J1的作用範点。
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1.1实验材料
1.1.1细胞及病毒株
HEK293T细胞，由美国纽约血液中央病毒免疫实行室提供；14个T-2635抗性株质粒由Dr Rogier W.Sanders惠赠；TZM-Bl细胞和MT-2细胞由美国National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program (NIHAIDSRRRP)提供。
1.1.2试剂
FuGENE 6转染试剂购自美国Roche Applied Science公司；焚光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；质粒小提和大提试剂盒，感受态细胞DH5a购自美国QIAGEN公司；RPMI-1640培养基，DMEM细胞培养基，新生牛血清，胎牛血清及胰蛋白酶/EDTA消化液，青霉素及链霉素购自美国Gibco公司；脱脂奶粉脱脂牛奶购自美国Bio-Rad公司；显色剂3,3’，5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，氨节青霉素，蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉，氯化钠，琼脂糖，吐温-20，PBS, Triton X-100购自美国Sigmal公司；C34，T-20由美国纽约血液中心Microchemistry实验室合成；ADS-J1由Ciba Specialty Chemicals公司合成；CaCb转染试剂为美国纽约血液中心病毒免疫实验室配制；HIV免疫球蛋白（fflVIG)，p24单克隆抗体183-12H-5C由美国 NIHAIDSRRRP 提供。
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第二章 编码N36Fd突变体的载体构建,蛋白表达纯化及突变体对ADS-J1活性影响... 55-71
2.1 实验材料.................................. 55-56
2.2 实验方法..................... 56-64
2.3 实验结果.......................... 64-71
第三章 ADS-J1对抗T-20耐药株和HIV-1临床分离株 .................71-78
3.1 实验材料 ...................................71-72
3.2 实验方法........................... 72-75
3.3 实验结果................................ 75-78
第四章 ADS-J1与临床抗艾滋病毒药物的协同作用............... 78-88
4.1 实验材料...................... 78-79
4.2 实验方法.............................................. 79-82
4.3 实验结果............................ 82-88
讨论
利用计算机辅助设计，将gp41 口袋区作为IB点，并结合我们建立以ELISA为手段的gp41 6HB抑制实验，我们成功筛选出ADS-J1小分子化合物，它抑制HIV介导的细胞融合和HIV-1复制活性达到低微摩尔水平[72，73]。机制研究表明，ADS-J1能够和一个可溶性杂交分子IQN17结合，并且能够显著抑制PIE7与IQN17 口袋区特异性地结合[8G]。IQN17是由GCN4序列和形成疏水口袋区的N-多肽N17联接组成，它可以模拟形成gp41三聚体上的口袋区结构。PIE7是一个能与IQN17 口袋区特异性地结
