第一章Parthenolide通过激活内质网应激诱导非小细胞肺癌细胞调亡
前言
1肿瘤
1.1肿瘤及肿瘤治疗
肿瘤是一种多基因到场、多步调生长的满身性、体系性疾病。癌症相干基因非常表达调控包罗原癌基因的激活和抑癌基因的失活,是导致肿瘤产生,无穷复制、血管天生、调亡躲避、免疫逃逸、侵袭及转移等非常生物学举动的基础缘故原由。
根据有关统计资料预测,未来肿瘤发病病人数将会以每年3?^?5%的速度增长,2020年全球新发肿瘤病例将有2000万,死亡人数将达到1200万。从发病率来看,收入处于中低水平的国家肿瘤发病率远远高于经济较发达国家⑴。
我国肿瘤发病率呈现明显的高发状态,肿瘤患者年龄也越来越年轻化。近年来我国癌症的发生类型有较大的变化,原来高发的结肠癌、胃癌等癌症的发病率均有不同程度的降低;而肺癌、乳腺癌等癌症的发病率却明显上升。
肿瘤治疗传统的方法主要有化学疗法、放射疗法和手术疗法。其中放射治疗周期漫长,费用昂贵,会引起人体产生多种并发症,对患者的生活质量有很大不利的影响。手术治疗则创伤较大,容易降低患者的免疫力,并有造成肿瘤的医源性传播的可能性[2]。
分子紀向治疗具有低毒性和高选择性的特点,主要对肿瘤细胞起调控和稳定作用,可以长期服药,因此可以在延长患者生存时间的同时提高生活质量,但分子IE向治疗对所用药物要求较高,须对肿瘤细胞有较强的祀向性,现有的很多化学药物并不能很好地满足此条件,因此,开发新型抗肿瘤化学药物迫在眉睫。
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2细胞调亡
2.1细胞调亡的概念
细胞调亡又称步伐性细胞去世亡,是一种自动的、高度有序的、受基因精致调控及一系列酶到场的、能量依赖的、极其庞大的历程。细胞调亡是现在细胞生物学中一个紧张的研究范畴,与细胞的生长发育亲昵相干。调亡混乱与肿瘤等很多人类疾病有关[ie]。
2.2细胞调亡的特征
细胞调亡程序启动后,细胞内发生了一系列结构变化,主要包括细胞收缩变圆,体积缩小,连接消失,与周围的细胞脱离,细胞质的密度增加,细胞器明显聚集,细胞核体积减小,线粒体膜通透性发生改变,跨膜电位消失,细胞色素C释放至胞衆,细胞核膜核仁破裂,核质浓缩,DNA降解为约180bp~200bp大小的片段;质膜上有小泡形成,膜结构完整性不被破坏,隣脂醜丝氨酸从膜内侧外翻至膜表面,细胞无内容物溢出,不引起周围细胞和组织的炎症反应,调亡细胞的遗骸最终被分割包裹入多个调亡小体,调亡小体迅速的被周围专职或非专职的吞喫细胞吞樓。
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材料材料与方法
1.实验材料
1.1细胞株
(1)非小细胞肺癌细胞A549,Calu-1, H157, H1299, H1792;猴胚肾细胞Cos7(American Type Culture Collection,Manassas, VA );
(2)A549/LacZ9,A549/cFLIP,H157/LacZ5,H157/L6,A549/PLK0.1 和A549/shE-cad细胞系通过慢病毒感染制备,方法参照参考文献。
1.2实验药品
Parthenolide(Calbiochem,Darmstadt, Germany),溶于 DMSO,配成 lOmmol/L储存液,避光,-20°C保存,实验时用细胞培养基稀释至指定浓度。
1.3实验试剂
(1)RPMI 1640 培养基,胰酶,SRB, TEMED,Glycine, Tris-base, Yeast powder,peptone, PI 均购自美国 Sigma-Aldrich;
(2)40%聚丙稀醜胺,DMSO,甘油,脱脂奶粉,吐温-20,过硫酰胺,EDTA,EB,甘油,Na2HP04均购自中国上海生工生物工程技术服务有限公司;
(3)异丁醇,甲醇,乙醇,氯化钾,KH2PO4购自中国国药集团化学试剂有限公司;
(4)MTT 试剂盒,X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent, PIC 均购自德国Roche;
(5)NP-40,Trixon-100,脱氧胆酸钠,NaN〕购自中国北京索莱宝科技有限公司;
(6)质粒提取试剂盒,琼脂糖购自中国天根生化科技有限公司;
(7)胎牛血清(中国天津市溺洋生物制品科技有限公司);
(8)新生牛血清(美国Gibco);
(9)三氯乙酸(中国天津市科密欧化学化剂有限公司);
(10)冰醋酸(中国天津市凯通化学试剂有限公司);
(11)蛋白分子量Marker (加拿大Fermentas);
(12)Millipore Immobilon Western 化学发光 HRP 底物(美国 Millipore)
(13)p-巯基乙醇(美国Amresco)(14)调亡检测试剂盒(中国南京碧波生物科技有限公司)
(15)其他如碳酸氢钠,盐酸等试剂均为国产分析纯。
(16)本论文所用的siRNAoligos均由中国Genephama公司合成,序列如下:
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2.主要溶液及试剂配方
2.1肿瘤细胞培养所用试剂及配方
(1)1640细胞培养基
1640培养基粉末 10.4g
NaHCCb 2.0g
三蒸水溶解,用浓盐酸调节PH至7.2?7.4,定容至1000ml,抽滤灭菌后4°C保存。
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第二章 内吞蛋白Numb及NumbL调控非小细胞肺癌细胞膜表面DR5 .................94-133
前言........................... 94-113
1 膜泡运输.................... 94-97
1.1 膜泡运输的概念 ....................94
1.2 膜泡运输的步骤 .............94-95
1.3 膜泡运输的调控 .............95-96
1.4 膜泡运输的分类......................... 96-97
2 内吞........................... 97-101
2.1 内吞的分类 .........................97-98
2.2 内吞的机制............... 98-99
2.3 内吞后膜泡的运输......................... 99-100
2.4 内吞的功能 ..................100
2.5 内吞和肿瘤 ...............100-101
3 死亡配体及其受体的内吞..................... 101-105
3.1 CD95及其受体的内吞 .................101-102
3.2 TNF及其受体的内吞..................... 102
3.3 TRAIL及其受体的内吞 .................102-105
4 内吞蛋白Numb ..................................105-111
4.1 Numb的结构............................ 105-106
4.2 Numb各结构的功能......................... 106-107
4.3 Numb的分布 .........................................107-108
4.4 Numb的功能 .............108-111
5 内吞蛋白NumbL.................. 111-113
5.1 NumbL的结构 ................111
5.2 NumbL的功能 .....................111-113
实验材料与方法(见第一部分) .....................113-118
1 实验材料 .............................113-114
1.1 实验试剂......................... 113-114
1.2 实验抗体....................... 114
1.3 主要实验仪器 .........................114
2. 主要溶液及试剂配方 ...............................114-115
2.1 Immunoprecipitation蛋白质裂解相关试剂及配方 ..............114
2.2 免疫荧光相关试剂及配方.................... 114-115
3. 实验方法 .............................115-118
3.1 质粒构建 .................115
3.2 流式检测细胞膜表面蛋白 ....................115-116
3.3 免疫荧光 .......................116
3.4 免疫沉淀 .........................116-118
实验结果 ................