砷剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用

关键词] 肿瘤细胞 砷剂，主要成分为三氧化二砷（As2O3），在祖国医药中被称为砒石。几世纪以前 ，砷剂就被人们用来治疗牛皮癣、风湿症、白血病、梅毒、痔疮等。目前临床上砷 剂的应用主要限于用有机砷治疗锥虫病或三氧化二砷作牙髓失活剂。哈尔滨医科大 学首先报道了静脉滴注As2O3治疗复发的急性早幼粒细胞白血病（APL）达到很高的 完全缓解率后，上海血液研究所发现As2O3可诱导APL细胞凋亡和部分分化。近年来 ，国内外对砷剂与肿瘤的研究发展很快，发现砷剂对恶性淋巴系统疾病、红白血病 甚至实体瘤有令人振奋的治疗效果。现就其生化作用及对肿瘤的诱导凋亡作用作一 综述。 1　砷的生化作用 砷作为微量元素，存在于正常人体内。其化学形式可分为三价砷(无机砷)和五价砷 (有机砷)，它们在体内的相互转换和代谢决定着砷的毒性作用。三价砷毒性较大， 易在体内蓄积，主要经胃肠道缓慢排泄;而五价砷则相对毒性较低，蓄积倾向低， 主要经肾脏较快排泄。进入人体后的三价砷在肝脏内还原发生甲基化，形成一甲胂 酸(MMA)或二甲胂酸(DMA)，从而被解毒。 砷是一种细胞原浆毒，细胞内的相邻巯基是三价砷的主要化学受体。应用含巯基的 还原型谷胱甘肽可阻断砷剂的毒性作用。含大量巯基的还原型角蛋白结合砷剂的量 为含较少巯基的氧化型角蛋白结合砷剂量的十倍。砷剂与酶分子内的巯基作用后可 抑制其活性。受影响的重要酶系统有丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸酯酶、细 胞色素氧化酶、脱氧核糖核酸聚合酶、白介素1β转化酶（ICE）等，从而直接影响 了细胞的代谢过程、染色体结构、核分裂等。 线粒体是对砷剂作用最敏感的细胞器，三价砷消耗了线粒体内亲水的巯基后，干扰 了线粒体内的离子平衡以及NAD(P)H的氧化，从而干扰了线粒体的能量代谢，引起 细胞功能的紊乱。砷剂是否对正常细胞有毒性作用取决于剂量，如As2O3治疗APL有 效血浓度及体外研究其对肿瘤细胞作用的有效浓度均在0.1μM～2.0μM，实验表明 As2O3在此浓度下对造血干细胞影响甚小[1]。 2　砷剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用 与正常细胞不同，肿瘤细胞生长失控，分化或凋亡受阻。近年来研究表明砷剂既可 诱导肿瘤细胞凋亡、部分分化，也可抑制其增殖。多项研究表明诱导凋亡为其杀伤 肿瘤细胞的主要机制。 2.1　开放MPT，活化caspase家族 研究表明，细胞凋亡发生的关键环节不在细胞核而在细胞质。虽然凋亡细胞呈现一 系列的特征性形态学变化，但这些改变仅仅是细胞凋亡的结果。凋亡细胞在被诱导 产生特征性形态学改变和DNA降解之前，一个最普遍的变化是线粒体膜功能的改变 即线粒体的通透性改变(permeability transition，PT)，这是调节凋亡的中心环 节。线粒体通透性转运孔道(MPT)是位于线粒体内外膜之间的多蛋白复合体，至少 包括胞质的己糖激酶、外膜的PBR、外室的肌酸激酶、内膜的ANT及基质的亲环蛋白 D（cyclophilin D）等。MPT通过调节线粒体基质中的Ca2＋、pH和电荷，维持线粒 体内环境稳定，保证氧化磷酸化通路通畅，对凋亡控制具有重要作用。砷剂与巯基 结合后，导致MPT开放，线粒体跨膜电位(△ψm)下降或消失，继之呼吸链脱偶联， 谷胱甘肽耗竭，活性氧类（reactive oxygen species，ROS）产生及对诱导凋亡非 常重要的蛋白酶活化物的释放，包括细胞色素C(Cyto-C)和凋亡诱导因子(AIF)， Cyto-C和 AIF均可激活caspase，caspase可诱导凋亡。 caspase即半胱氨酸蛋白酶家族。在NB4（一种APL细胞系），U937及SHSY5Y成神 经细胞瘤等细胞系中均可见As2O3等砷剂诱导的凋亡相关的caspase激活[2，3]。根 据其在细胞凋亡中的作用可分为始动(上游)caspase(caspase2，8，9，10)和效应 (下游)caspase(caspase3，6，7)两大类。前者在凋亡诱导信号作用下结合特异辅 因子而活化，并进一步活化后者。而caspase抑制剂(ZVAD，fmk等)可阻止砷剂诱 导的凋亡。因而caspase的活化级联形式是砷剂诱导凋亡的重要通路。综上所述， 砷剂引起的MPT开放和△ψm破坏是决定细胞生存与否的关键，而caspase是砷剂诱 导凋亡的下游效应物，其活化可诱导细胞凋亡。 2.2　改变细胞内氧化还原状态 细胞内ROS的产生和抗氧化代谢的平衡往往是决定细胞生存与否的关键。蛋白的氧 化作用可能是改变核基因转录的重要步骤，氧化作用通过基因转录改变细胞的表型 以便进一步启动凋亡的发生，且凋亡的最后阶段需要氧化过程的参与，如细胞膜蛋 白的氧化能开放离子通道间接地导致细胞皱缩，通过组蛋白的氧化修饰作用导致染 色体结构的改变。砷剂可使细胞内ROS生成增多是由于：（1）MPT开放，线粒体内氧化呼吸链受阻，致ROS外漏。（2）活化黄素蛋白依赖的超氧化物酶（如NADPH氧 化酶），使H2O2产生增多，后者可通过从线粒体释放Cyto-C，活化caspase-3并裂 解多聚ADP核糖多聚酶(PARP)而介导凋亡（PARP在DNA受损时可识别并结合到DNA断 裂处被激活而参与DNA的修复，是细胞凋亡中第一个被鉴定为由caspase-3降解的D NA修复酶）；又可通过与线粒体巯基形成复合物而降低GSH的活性等途径使ROS清除 减少。故砷剂可通过改变细胞内的氧化还原状态诱导凋亡。但将细胞培养于氧浓度 低于10ppm不可能产生ROS的条件下，仍可发生凋亡，故这可能只是机制之一。 2.3　快速调变PMLRARα融合蛋白的亚细胞定位 APL细胞特征性染色体易位t(15;17)导致早幼粒细胞白血病基因(PML)和维甲酸受体 α基因(RARα)融合，表达PML-RARα融合蛋白。通过转基因小鼠实验可证实PML-R ARα融合蛋白是APL发病的主要分子基础。体外研究表明，PML-RARα融合蛋白既阻 断APL细胞的分化，也使APL细胞凋亡受阻。早期认为砷剂通过降解此蛋白而诱导A PL细胞凋亡，称之为维甲酸受体信号通路[4]。正常血细胞中野生型PML与RARα等 共定位于核体(PODs)中。大多数APL细胞因PML-RARα与PML形成异二聚体而使PODs 结构解体，阻止细胞分化及抑制凋亡。砷剂使PML， PML-RARα重新共定位于PODs 并快速降解之。该现象与APL细胞凋亡以及二硫键还原剂二硫苏糖醇(DTT)抑制NB4 细胞凋亡与抑制PML-RARα快速降解在时相上均有一定的相关性，被认为是砷剂治 疗APL的机制之一。但有实验显示[5]，在PML－小鼠(不含PML基因的小鼠)，As2O3 同样能抑制细胞增殖及诱导凋亡，且其诱导凋亡效应不仅见于APL细胞，还可见于 非霍奇金淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞及某些正常细胞，故其诱导凋亡机 制是非特异性的，维甲酸受体信号通路并非是砷剂诱导凋亡的惟一机制。 2.4　抑制Bcl-2基因 Bcl-2基因即细胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的与凋亡有关的基因[6～9]，是 一种凋亡抑制基因，又称长寿基因，是维持癌细胞无限制生长的主要基因。Bcl-2 家族包括Bcl-2、Bax、Bcl-X、Bcl-w、Bak、Bad、A1 、NR-13和Mcl-1，其中Bax、 Bak、Bcl-Xs是促凋亡因子，其余为抗凋亡因子。Bcl-2对细胞周期无明显影响，而 对细胞死亡的干扰有选择性，阻止了细胞死亡的最后途径，包括核苷酸内切酶对D NA的降解。Bax是Bcl-2的一种同源蛋白，Bax既可以形成同聚体，又可与Bcl-2形成 异二聚体，Bax蛋白与Bcl-2蛋白的比值影响着细胞受到刺激后发生凋亡的比率。目 前认为，Bcl-2家族促凋亡因子和抗凋亡因子的相对表达水平至少部分决定了细胞 对凋亡信号的反应性。大量实验表明，Bcl-2与Bcl-X l能够抑制MPT开放和维持线 粒体△ψm，进而抑制Cyto_C和AIF从线粒体释放入胞浆并阻断了ROS的生成，增加 胞内GSH含量并促进其向核内转移，即有细胞内抗氧化作用。在砷剂诱导的NB4、U 937及B细胞白血病细胞系LyH7细胞凋亡中Bcl-2表达下调[10]。在1.0μM As2O3诱 导NB4细胞凋亡时[11],CPP32（caspase3）被激活和降解PARP，同时Bcl-2不仅在m RNA水平而且在蛋白质水平均被下调；而在1.0μM As2O3诱导恶性淋巴性白血病细 胞凋亡过程中既无CPP32激活又无Bcl-2调变，提示砷剂诱导的凋亡中Bcl-2发挥的 作用各异。有实验表明，2.5μM As2O3[12]使肝癌细胞系Hep201Bcl-2表达明显下 降，而凋亡的促进因子Bax的表达明显增加，两种基因表达比例发生变化。又有报 道，10μM As2O3处理人肝癌QGY-7701、QGY-7703细胞48小时后其Bcl-2基因表达明 显下降，Bax和Fas基因表达明显增强，Bax蛋白与Bcl-2蛋白比值增加。对Bax、Bc l-Xl等基因是否表达各报道不同[13～15]。Bcl-2的过度表达可抑制砷剂诱导的凋 亡相关现象，而通过反义技术使Bcl-2下调可抑制细胞增殖及促进凋亡。综上所述 ，砷剂可通过对Bcl-2基因的抑制诱导某些肿瘤细胞的凋亡。但As2O3并不影