疫苗抗原性口腔科学上的研究分析

疫苗抗原性口腔科学上的研究分析

摘　要　目的:研究人工合成葡糖基转移酶GTF第552~570位的多肽疫苗HDS的免疫原性。方法:将HDS与大分子载体钥孔帽贝血蓝蛋白偶联后,医学论文范文在腮腺区皮下免疫大鼠,取鼠血清,Western blot法检测鼠血清抗GTF抗体。结果:硝酸纤维膜上43KD-66KD间出现强阳性条带,此条带位置与葡糖基转移酶经SDS-PAGE电泳后条带位置一致。结论:抗人工抗原HDS-KLH抗体能与葡糖基转移酶发生抗原抗体反应,抗HDS-KLH抗体具有识别葡糖基转移酶的能力。

关键词 龋病 变形链球菌 葡糖基转移酶 多肽 疫苗

ABSTRACT　Objective:To investigate the antigenicity of the peptide vaccine HDS(552~570) from Streptococcus mutans glu-cosyltransferase(GTF).Methods:HDS was conjugated with keyhole limpet hemocyanin,a kind of carrier protein,to form a largemolecule protein HDS-KLH,which was injected in the vicinity of rats.The sera of rats was collected and Western blot assay was doneto demonstrate whether there were specific antibodies to recognize GTF in rats anti-HDS-KLHserum.Results:There appeared an pos-itive strip between 43kd~66kd in the fibrous membrane,which related to findings in SDS-PAGE.Conclusion:The ability of anti-HDS-KLH recognizing GTF was demonstrated in this study.

KEY WORDS　dental caries　Streptococcus mutans　glycosyltransferase　polypeptide　vaccine

龋病是一种细菌感染性疾病,变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans,变链菌)是它的主要病原菌[1]。在变链菌表达蛋白中筛选既有防龋作用,又不与心肌细胞或其它细菌发生交叉反应的抗原表位是疫苗研究中的新热点。亚单位多肽疫苗具有分子量小,发生交叉免疫反应的可能性小等优点,目前越来越受到重视。本研究合成来源于葡糖基转移酶(glycosyltransferase,GTF)第552~570位的多肽序列HDS(根据其核心的三个氨基酸命名),使多肽HDS(分子量2148Da)包含与GTF致龋性密切相关的氨基酸位点His561、Asp562和Asp567,并将多肽序列与大分子载体钥孔帽贝血蓝蛋白偶联,免疫大鼠,通过检测血清抗体反应观察多肽疫苗的免疫原性。

材　料　和　方　法

材料:多肽HDS(军事科学院病毒所合成);GTF(长春生物制品研究所赵小琳副教授提供。变链菌IngbrittGTF基因克隆至大肠杆菌,获得高效表达菌株,菌株发酵培养,获得抗原并纯化[3]);出生20天的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只;致龋饲料2000#。

方法:

1　人工抗原(HDS-KLH)的制备:载体蛋白的偶联[2]:A液:15mg钥孔帽贝血蓝蛋白溶于2ml甘油,B液:5mg多肽HDS溶于1ml二甲基亚砜,A液和B液混合后加入偶联剂碳二亚胺(EDS)5mg振荡1h后,置于磁力搅拌器上搅拌过夜,次日层析分离。

纯化人工抗原(HDS-KLH):取溶胀好的葡聚糖(SephadexG-50)30 ml,以pH7·2PBS装柱并平衡,以紫外检测仪280nm检测,第一峰为结合了钥孔帽贝血蓝蛋白的多肽,收集合并含蛋白的洗脱液,测定蛋白浓度,置-20℃保存。

2　动物免疫:将35只出生20天的雄性SD大鼠随机分成4组。鼠龄21天,分别用葡糖基转移酶(GTF),多肽抗原(HDS),人工抗原(HDS-KLH)及PBS,配合等体积完全福氏佐剂,在腮腺区皮下免疫大鼠,每只大鼠每次免疫剂量为0·5ml。鼠龄35天,再次免疫(抗原同前但配合不完全福氏佐剂)。鼠龄第49天时,每只大白鼠称重后,按2·5mg/100g体重的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,使鼠镇静同时吞咽反射正常,收集静脉血标本。

3　免疫印迹(Western blot)试验:SDS-PAGE分离GTF蛋白并转移至硝酸纤维膜,分别加入鼠抗GTF血清(阳性对照)、鼠抗HDS-KLH血清(一抗)、对照组鼠血清(阴性对照),鼠血清抗体稀释100倍,每袋3ml,室温下置于摇床振荡1·5h,PBS洗膜3次,每次15分钟,加入二抗(羊抗鼠IgG,1∶1000),室温置于摇床振荡2小时,PBS洗膜2次,每次5分钟。选用四甲基联苯胺显色系统。

结　　果

鼠抗HDS-KLH血清作为一抗时,硝酸纤维膜上约55KD处出现一条明显条带,背景清晰,与聚丙烯酰胺凝胶电泳后凝胶上条带出现的位置一致(图3),和文献报道比较[3,4],证明此条带是GTF特异性条带。而用阴性对照组鼠血清或PBS作为一抗时,硝酸纤维膜上未见明显条带。结果说明,鼠抗HDS-KLH血清能与GTF发生特异性抗原抗体反应。

讨　　论

目前免疫防龋研究致力于寻找能抑制变链菌对牙面粘附的疫苗。人们对变链菌疫苗研究对象的选择经历了由整个细菌细胞,到细胞表面毒力因子,直到毒力因子中某部分氨基酸序列-多肽疫苗的逐渐缩小的过程,目的是尽量将与变链菌致龋作用无关的部分摒弃在疫苗之外。多肽疫苗由几个到几百个氨基酸组成,是用单一保护性抗原、甚至单一主要抗原决定簇来代替完整的病原体疫苗免疫机体,诱导机体产生抵抗入侵相关病原体的免疫反应,能避免因病原微生物与机体组织之间存在共同抗原而引起的免疫病理反应。做为疫苗的多肽既要与GTF活性密切相关,又要包含能刺激抗体生成的表位。本研究确定GTFβ7环状结构上的552~570位一段多肽链HDS,HDS包含酶活性相关,且在所有变链菌GTF中高度保守的氨基酸位点His561、Asp562、Asp567,用该疫苗免疫动物,定性检测动物血清中抗体生成情况。

游离的合成肽免疫动物,一般只引起中等强度的免疫应答,将小分子肽连接到大分子载体上,形成多肽-载体嵌合体后,再免疫动物,被单核巨噬细胞等抗原呈递细胞识别并处理后呈递给T、B淋巴细胞,可促进机体对合成肽的免疫反应。将合成肽与大分子载体连接后组成的免疫原通常称为人工抗原。常用的偶联方法有戊二醛法、碳二亚胺法、活泼酯法、亚胺酸酯法和卤代硝基苯法等。这些偶联方法是使半抗原与载体在-COOH、-NH2、-SH等基团部位发生结合。偶联剂碳二亚胺是一种很强的脱水剂,化学性质活泼,其偶联反应既可在氨基部位,也可在羧基部位,将羧基和氨基脱水形成酰胺键。反应是一种分子中的羧基先与碳二亚胺反应生成一个加成中间产物,再与另一分子上的氨基反应形成酰胺键,实现两者的交联。载体蛋白除应具有较好的免疫原性,还应具有足够的反应侧链氨基酸残基,以便于与合成肽连接。钥孔帽贝血蓝蛋白分子量大,以碳二亚胺作为连接剂,一个蛋白分子可连接多个多肽,产生的抗体亲和力高,特异性强。本试验选用钥孔帽贝血蓝蛋白作为载体蛋白,与多肽HDS偶联形成人工抗原。

本实验对鼠抗HDS-KLH血清,用标准GTF进行Western Blot检测,结果显示鼠抗HDS-KLH抗血清能与GTF发生抗原抗体反应,且条带出现位置与GTF电泳后凝胶上出现位置一致,而阴性对照组鼠血清不能与GTF反应,证实鼠抗HDS-KLH抗体具有识别GTF的能力。结果说明,源自GTFβ7管状结构,含有功能重要氨基酸的多肽序列HDS,与大分子载体钥孔帽贝血蓝蛋白偶联后,能在动物体内诱导产生与来源蛋白GTF反应的抗体。此结论为进一步研究多肽疫苗防龋作用奠定了基础。

参　考　文　献

1　Bowen WH.Wither or whither caries research? Caries Res.1999;33(1):1

2　Lei S,Raftery MA,Conti-Tronconi BM.Monoclonal anti-bodies against synthetic sequences of the nicotinic receptorcross-react fully with the native receptor and reveal thetransmembrane disposition of their epitopes.Biochemistry.1993;32(1):91

3　赵小琳,宋昌玲,姜　崴等.基因工程变链菌防龋疫苗的研制.微生物免疫学进展.1998;26(3):10

4　Ferretti JJ,Huang TT,Russell RR.Sequence analysis of theglucosyltransferase A gene (gtfA) fromStreptococcus mu-tansIngbritt.Infect Immun.1988;56(6):1585