本文是一篇职称论文，本文利用重庆市典型润滑油污染土壤，从中分离出一株高效石油烃降解菌 R13，经鉴定为皮式不动杆菌（Acinetobacter pittii）；通过对该菌的生长条件及降解特性进行系列探究，证实了该菌具有优良的润滑油降解特性；采用响应面法优化得到其最优的生物降解条件；利用绿色荧光蛋白（GFP），对 A.pittii R13 进行了分子生物学荧光标记，追踪其在土壤中的生长情况，结合润滑油降解情况，评价不同生物周期下润滑油污染土壤的修复效果。
第一章 绪论
1.1 微生物修复石油烃污染研究进展
1.1.1 石油烃污染环境概述
机械加工、加油站等场所和诸多行业，均会因泄漏、操作不当等不可避免产生油污染土壤问题。由于表面张力、毛细作用及重力影响，残留在土壤中的石油烃难以被去除，而在保水性差的土壤中石油烃更易渗入地下水体或随降雨进入地表径流，从而影响了区域的生态平衡[1-2]。近些年来，随着我国工业化进程的逐渐完善，有着“工业血液”的石油行业得到快速发展，然而石油烃泄露造成的土壤污染问题日趋严重。
除中国外，其它国家仅石油开采、运输、储存以及各种事故性泄漏等原因就可导致每年约 1000 万吨石油进入自然环境中。而世界能源统计报告显示 2019 年各国石油产量总计 39.15 亿吨，各种因素导致的落地油大面积污染土壤[3]。以我国为例，单井落地原油可污染 0.5-2.1 m2 土壤。这种情况在北方产油区尤为明显，以辽河油田为例，重度污染区域土壤表层（0-20 cm）石油烃含量高达 30％-50％，其土壤中竟含有 1.0×104 mg/kg原油，超出临界值（500 mg/kg）20 倍[4-5]。
润滑油作为典型石油烃在日常生活中较之原油使用更多，造成的污染也更严重，由于润滑油中链烷烃长度大多高于 17 同时含有难降解多环芳烃，加之各种添加剂，其相对传统石油烃更难降解[6]。我国自 2018 年成为世界上最大的润滑油消费国，据中国物资再生协会再生油专业委员会最新统计，2018 年我国润滑油消费量高达 648 万吨，且消耗量正逐年攀升[7]。经过长期使用的润滑油油品逐渐劣化变成废油，同时全球性石油资源的匮乏，使得废旧润滑油的回收与再生成为研究热点。然而回收渠道的闭塞、公民意识的缺乏及高昂的处理成本，目前美国在润滑油回收技术领域的研究相对深入，但其仅有18%的废润滑油被有效回收并利用，大部分废旧润滑油未经处理就流入环境[7]。部分成品润滑油在生产、加工、储运及使用过程中，因工艺本身或操作不当等因素，也会导致润滑油不可避免地直接进入环境。重庆以制造业为支柱产业，是我国的制造业大省市，在各行业领域生产过程中不可避免产生各类油料污染土地问题，污染源主要包括汽油、柴油和润滑油，其中润滑油污染占据了主要地位[8]；同时，由于近年来重庆市工业化工园区布局工作的推进，特别是对油料加工企业不断加强的规范化管理，很多工厂迁移至工业园，油企在整体搬迁后，遗留土地均呈现不同程度的油污染[9,10]。
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1.2 绿色荧光蛋白及其在生物修复中的应用
1.2.1 绿色荧光蛋白发展及发光机理
绿色荧光蛋白(GFP)是从水母(Aequorea victoria)中分离出来蛋白质其由 238 个氨基酸残基组成，特殊的构造使其能够紫外光（395 nm）和蓝光（470 nm）的激发下发出绿色荧光[54]。自 1962 年 Shimomura 从水母中发现 GFP 以来，在分子生物学发展的四十年间，大量科学家对其结构进行改良研究，使得这种蛋白可广泛应用于大分子物质在活体细胞中的定位、迁移及结构的研究，而在原核生物的追踪领域，也取得了良好的实验效果[55-57]。
GFP 具有高度稳定的β结构，其发色团经过折叠后位于桶状结构中央，由含酪氨酸的三肽的环化和氧化而组装，而结构两端则由短状的α螺旋覆盖。生色团由β结构内的氢键网络包裹，这种以发色团为中心的固定三维结构与绿色蛋白荧光产生及发光强度有着密切联系[58]。一是这种自催化氧化的方式使得 GFP 不需要其他外部底物提供分子氧；二是处于激发态的中间体不会因为结构影响发生翻转；同时，氢键网格为处于激发态的质子提供转移通道，保证了荧光的稳定。Walker 等[59]通过开发新的发色团，使其应该能够在特定反应中启动。Henderson 等[60]对 GFP 结构的荧光可逆性质进行研究观察，证实了其快速和完全的荧光丧失是由发色团的顺反异构化造成的，同时结构稳定性较强。可见，GFP 结构的特殊性，使得科学家能够对发色团进行不同修改使其能够适应不同的微生物生长环境。
图 1.4 绿色荧光蛋白桶状结构正面及俯视图
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第二章 润滑油降解菌的分离与鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 菌种分离源及降解底物
由于各行业领域机加工过程不同，普遍存在包括机油、液压油、变压器油、绝缘油、冷却油，以及分散剂和清洗剂等各种用途的润滑油，这些油料在机械运行、维护、保养、更换油料过程中不可避免地污染环境。而传统观点认为，从污染场地中分理出的菌株，经驯化改良，辅以修复助剂，能够更好地降解污染场地的石油烃。
因此，针对政府和企业关于石油烃污染场地治理实际需求，实验室选择典型的机加工土壤为分离源，走访调研重庆市机加工污染场地，选取了具有代表性的三家油污染厂址进行样品采集。通过为期一月的高浓度润滑油驯化，在淘汰生存能力较差菌种的同时对土壤中能够降解润滑油的菌株进行耐受强化。采用 LB 富集培养、无机盐选择培养基筛选、平板涂布分离等常规分菌方法，从土壤中分理出能够降解润滑油的菌种。利用 24孔板初筛、摇瓶降解复筛结合菌落形态及革兰氏染色法筛选出高效降解菌株，验证菌株生理生化特性并对其进行 16S rR NA 基因序列分析，构建系统发育树。
（1）菌种分离源
污染土壤样品取自重庆市永川中明环保旧址、潼南阿尔法润滑油再生企业、长辉焦化厂旧址。
（2）降解底物
废旧润滑油样品取自重庆工商大学教育部废油研究中心中试试验基地。
2.1.2 实验试剂
实验所需主要化学试剂见表 2.1。
表 2.1 主要化学试剂
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2.2 实验方法
2.2.1 污染土壤采集
在永川的中明环保厂区旧址，分别采集了原料贮存地面、油罐区地面，及厂区地面三处土壤样品；原长辉焦化厂旧址，也分别采集了两处不同的土壤样品；从潼南阿尔法润滑油再生企业中采集的污染土壤颜色较深，为褐色和黑色，且有明显的油污味。图 2.1为现场采样及污染土壤照片。采样时去除表面浮土和杂物，由于部分厂区表层土壤石油烃挥发及油液下渗，采样深入表层至地下 30 cm。
2.2.2 细胞密度检测
细胞密度采用国内外通用的紫外可见分光光度法进行检测，以未加菌的无机盐培养基为空白对照，在 600 nm 下检测发酵液吸光度。
2.2.3 土壤含油量检测方法
土壤中石油烃含量的检测方法采用超声-索氏提取-紫外法测量。实验具体步骤如下：将土壤样品烘干至恒重，破碎研磨，称取 10.0 g 土样，用滤纸包好放入 50 mL 离心管中，加入 25 mL 石油醚，盖紧、超声 15 min，重复三次，用镊子将纸包夹到索氏提取器中，提取 3 次后将离心管中的提取液以石油醚为参比测定 OD258nm 值。
2.2.4 土壤中全氮、全磷含量检测方法
土壤中全氮含量的检测采用 GB 7173 -87 土壤全氮测定法(半微量凯氏法)；土壤中全磷含量的检测采用 GB 9837-88 土壤全磷测定法。
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第三章 皮特不动杆菌降解特性研究......................................35
3.1 实验材料与仪器设备.........................................35
3.1.1 实验材料..............................35
3.1.2 实验试剂及仪器...................35
第四章 构建基因工程菌............................48
4.1 实验材料与仪器...........................................48
4.1.1 实验材料.................................................48
4.1.2 实验试剂及药品...................................48
第五章 润滑油污染土壤生物修复研究................................61
5.1 实验材料与方法......................................61
5.1.1 实验材料.........................................61
5.1.2 试验方法.................................61
第五章 润滑油污染土壤生物修复研究
5.1 实验材料与方法
5.1.1 实验材料
（1）菌株：高效润滑油降解基因工程菌 A.pitti R13。
（2）营养盐溶液：每升水 NH4NO3 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，NaC l 0.2 g，CaCl2 0.05 g，MgSO2 0.05 g，FeS O4 0.05 g，MnSO4•H2O 0.01 g，Na2MoO4•2H2O 0.01 g，pH 7.0，121℃灭菌 25 min。
（3）污染土壤：
