前言
阿尔茨海默病(AD)是世界范围内最普遍的神经退行性疾病，年龄是它发生的最主要的风险因子。主要表现为记忆丧失和认知功能障碍，行为改变包括偏执、妄想和语言功能下降[1]。目前还没有一个治愈和预防的最佳策略，随着未来医学的进步，人类寿命的延长，他的发生率将会持续增长[2]。阿尔茨海默病两个病理特点是在大脑皮层内大量神经元纤维缠结和脑内大量的淀粉样老年斑[3]。关于 AD 的发病机制有多种学说，比如 Aβ 毒性学说、Tau 蛋白异常修饰学说、胆碱能损伤学说、自由基损伤学说、钙平衡失调学说、炎性反应机制学说等[4]，但是目前还没有一种学说能全面合理地解释 AD 的发生发展，这说明可能由多种原因，多种病理作用共同导致疾病的发生。越来越多的研究显示，Aβ 是各种病因诱发阿尔茨海默病的共同通路，是 AD 形成和发展的关键因素[5]。近年来，Aβ 毒性学说已成为阿尔茨海默病发病机制的中心学说被普遍接受。Aβ 是由细胞膜上淀粉样前体蛋白的异常剪切和错误折叠导致的[6]。APP 是第一个被发现的突变导致 AD 的基因。人类 APP 基因位于 21 号染色体的长臂上，至少含有 19 个外显子。大多数与家族性阿尔茨海默病(FAD) 相关的APP 突变集中在 α、β、γ-分泌酶裂解位点附近。突变的 APP 导致 Aβ42的过度产生[7]。正常情况下，APP 经由 α 分泌酶剪切，释放大量可溶性的 N 端片段（sAPPα）进入胞外区域，保留一个含有 83 个氨基端残基的 C 末端片段。这条途径是非致淀粉样病变的，因为 sAPPα 具有促进轴突生长和保护、营养神经元的作用，而 C83 只包含了部分的 Aβ肽，这种裂解方式没有 Aβ 的产生。在 AD 患者体内，APP 的代谢途径发生了改变。APP经过 β 分泌酶裂解产生一个含有 99 个氨基酸残基的胞外片段(sAPPβ)在膜上，此片段包含了完整的 Aβ 肽，经 γ 分泌酶裂解，产生了具有致病作用的 Aβ。APP 经过 γ 分泌酶剪切后产生不同长度的 Aβ 残基，其中 40 和 42 个氨基酸残基最多[8]。后者更容易沉积，是形成老年斑的主要物质。Aβ 沉淀能在脑中自发地形成 β 折叠结构，这些 β 折叠进一步堆积就形成了脑中的淀粉样老年斑，导致突触损伤和神经元丢失。Aβ 毒性学说认为Aβ 在老年痴呆的发病过程中起到至关重要的起始及枢纽作用[9]。
Notch 是进化上高度保守的信号转导通路，最初在果蝇中被发现，由于该基因缺失导致果蝇翅膀缺刻而得名[10]。Notch 参与调控几乎所有组织和器官的细胞增殖、分化和凋亡[11]。Notch 信号通路由 Notch 受体、配体、初级效应分子、靶基因构成。Notch 受体是一个单次跨膜蛋白，由胞外亚基和跨膜亚基组成，配体也是单次跨膜蛋白。在脊椎动物中已被确认的有四种受体（Notch1-4）和五种配体（jagged 1 、2；Delta- like 1、3 、4）[12]，Notch 基因编码含有单一的跨膜结构域受体。虽然最初形成时是单一蛋白质，但嵌入细胞膜上时，它一分为二，以异源二聚体受体存在。当一个细胞上的 Notch 受体与相邻细胞的配体结合，这种相互作用触发去整合素和金属蛋白酶 ADAM 10/ADAM17、γ 分泌酶水解 Notch 跨膜区释放胞内片段。该游离的片段经转运进入细胞核，与转录因子 CSL[CBF1、Su(H)、LAG1]结合，导致以前结合到 CSL 的共抑制因子激活转位，形成一个短期的核转录复合物，诱导下游基因的转录表达[13]。Notch 信号通路调控多种细胞发育过程，包括维持干细胞自我更新、增殖和分化[14]，以及细胞凋亡[15]。在神经系统，Notch 信号通路在早期神经发育，干细胞维持[16, 17]，胶质细胞的再生，学习、记忆方面有重要作用[18]。近年来人们意识到 Notch 信号通路的作用也参与到晚年的神经退行性疾病中[11, 19]，但是 Notch 信号通路在成年神经系统和 AD等神经退行性疾病中的作用研究还处于探索阶段。γ 分泌酶是一种广泛分布于全身各组织中的蛋白酶复合体。PS1 和 PS2 的基因编码的蛋白质分别有 467 和 448 个氨基酸，八或九个跨膜结构域。这两种蛋白之间有 65％的序列同源性，他们是 γ 分泌酶复合体的催化亚基，还有三个辅助亚基 APH-1 (anteriorpharynx-defective 1)、Nct (nicastrin)和 PEN2 (presenilin enhancer protein 2)共同组成 γ 分泌酶复合体[20]。除了裂解 APP，γ 分泌酶还有许多Ⅰ型跨膜蛋白作为底物，包括 Notch、ErbB4、CD44、Nectin-1a、E-cadherin 以及低密度脂蛋白受体相关蛋白[21]。Notch 作为 γ分泌酶的底物并在学习和记忆中起着重要的作用，预示着 Notch 信号可能与 AD 的发病机制有关。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
本实验所用动物为 B6/J-Tg(APPswe，PSEN1dE9)转基因模型小鼠，C57BL/6J 背景，表达突变的人类早老素 1(PS1-dE9)和人鼠淀粉样前体蛋白(APPswe)融合体，即 APP 的K595N/M596L 的突变体和第 9 位外显子缺失的 PSEN1 基因。购于南京大学模式动物研究所，品系编号 D000268。APP/PSEN 转基因雄鼠与 C57BL/6 工具雌鼠交配繁殖子代，经基因型鉴定后阳性子代小鼠用于实验，对照鼠为同窝阴性小鼠。用普通 SPF 级饲料饲养，水为灭菌水。动物饲养于 22±2 ℃的环境中，光照周期为 12 h:12 h(光照起止时间为：7:00-19:00)。细胞实验：所需浓度为 100 μM，称取 23 mg melatonin 粉末溶于 1 mL 的 70%乙醇溶液中，配成 100 nM 溶液。完全溶解后，用 0.22 μm 微孔滤膜在超净工作台过滤除菌后，4 ℃避光保存，用时稀释 1000 倍使用。动物实验：注射剂量为 50 mg/kg。称取 50mg melatonin 粉末溶于 300 μL 70%乙醇溶液中，4℃避光保存。用时用生理盐水稀释成 2.5 mg/mL，每只小鼠按 0.6 mL/30g 注射。
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1.2 方法
剪取大约 0.5 cm 鼠尾，放入 1.5 mLEP 管中，在 EP 管中分别加入 500 μL digestionbuffer 和 5 μL 10 mg/mL 的蛋白酶 K，混匀后，将 EP 管放入 55℃的水浴锅中，消化过夜。第二天，把消化好的组织用力摇匀，加 250 μL 饱和 NaCl 溶液，涡旋 20s，12000 rpm，离心 10 分钟，此时会看到很多蛋白质沉淀。转移 400 μL 上清至新的标记好的 1.5 mLEP管内，加预冷的无水乙醇 800 μL，上下颠倒，此时有白色丝状的 DNA 析出，12000 rpm离心 10 分钟，弃上清。加入 800 μL 预冷的 70%乙醇，12000 rpm 离心 5 分钟，吸取上清液，尽量把液体吸干净。沉淀即为提取的 DNA。晾干（大约 30 分钟）后，加 100 μLTE buffer 混匀，放 37℃水浴中助溶。测浓度，然后直接 PCR 或者﹣20℃保存。
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2 结果...... 23
2.1 APP/PSN 模型小鼠的鉴定 .... 23
2.2 THIOFLAVIN S 染色法鉴定淀粉样老年斑在小鼠脑中的沉积 ..... 24
2.3 WERTERN BLOT 检测 NOTCH 信号通路相关蛋白在小鼠脑中的表达.......... 25
2.4 染色质免疫共沉淀检测 NOTCH 信号通路活性 .......... 26
2.5 MELATONIN 对老年小鼠 NOTCH 信号通路以及 AΒ 沉积的影响 ......... 28
2.6 AD 细胞模型 MELATONIN 给药后 NOTCH 信号通路的变化 ...... 29
2.7 AD 细胞模型 MELATONIN 给药后 AΒ 的变化 ....... 30
3 讨论...... 33
4 结论...... 37
3 讨论
阿尔茨海默病作为一种不可治愈的神经退行性疾病，其发病机制的研究以及找到合适的预防和治疗手段，已经成为世界范围的难题。而 AD 模型动物是理想的研究手段，本实验选取了 APP/PSN 转基因小鼠作为动物模型。它是把人类突变的 APP/PSN 基因导入小鼠体内，使小鼠表现出人类阿尔茨海默病的特征，用于实验研究。用 PCR 技术对小鼠的基因型进行了鉴定，并用 TS 染色技术呈现出不同年龄段小鼠 Aβ 沉积的情况。结果显示在 APP/PSN 小鼠 6 个月时，已经开始出现 Aβ 的沉积，在 12 个月时，已经有非常明显的 Aβ 沉积。这与之前的报道也很吻合。尽管阿尔茨海默病发生和发展的原因还不确定，但是越来越多的证据显示，APP 的错误剪切，导致脑内 Aβ 肽，特别是 Aβ42水平的升高，是一切形式的阿尔茨海默病不变的特征。因此，淀粉样蛋白假说是被普遍接受的 AD 发病和进展的机制。γ 分泌酶作为一个膜蛋白酶复合体，它介导了
