本文是一篇医学论文发表，本文的结论有：1. 在 A549 细胞中，EMCV 病毒蛋白 2C 和 3A 可通过自噬溶酶体途径降解 HSP27，并与 HSP27 相互作用共定位于胞质。2.上调 HSP27 可显著抑制 EMCV 增殖；下调 HSP27 可显著促进 EMCV 增殖，表明 HSP27 在 EMCV 体外增殖中发挥负调控作用。
第一章 文献综述
1 脑心肌炎病毒的研究进展
EMCV 是心病毒属的一种没有囊膜的单股正链 RNA 病毒，其宿主广泛，主要包括小鼠、豚鼠、猪等啮齿动物和大猩猩、猕猴和长臂猿等哺乳动物[1]。一旦感染该病毒，通常可在患病动物的脑部和心脏发生局部病灶，并且有研究表明其可引起糖尿病、生殖机能障碍和神经系统紊乱等疾病[2,3]。EMCV 对所有细胞均易感，且存在组织嗜性。该病毒感染细胞后可导致细胞大量溶解，进而引起机体发生强烈的炎症反应[1,4]。其致病性的强弱主要取决于宿主和病毒毒株两个方面[5]，并且 EMCV 的致病机制与毒株类型和宿主特异性有关。目前，该病毒的相继爆发和流行给国内外畜牧养殖相关行业的发展造成了很严重的经济损失，给世界公共卫生和人类健康带来了一定的威胁[6,7]。
1.1 EMCV 的来源及类别
EMCV 是心病毒属的一种没有包膜的单股正链 RNA 病毒[1,6]。1945 年，美国的 Helwig 和 Schmidt 第一次从猝死雄性长臂猿体液中分离得到 EMCV，并且经体内注射和鼻腔滴注等方法在小鼠身上验证了该病毒的临床特征。并根据其临床症状将该病原体命名为 EMCV，随后 EMCV 被确定为感染许多家畜和野生动物的病原体[8,9]。1948 年，乌干达恩德培的 Dick 等人从一只患有后肢瘫痪的圈养恒河猴分离到一种 Mengo 病毒，其与 EMCV 病毒抗原性相似，且 1949 年关于两种病毒的血清学研究表明，Mengo 病毒是 EMCV 的唯一血清型[10-12]。1966 年，Craighead经过多次小鼠的病理刨检实验将 EMCV 分为溶肌型（M 型）和神经型（E 型）两个变异体[13]。随后，1980 年 Yoon 等通过空斑实验对 EMCV 的 M 变异体进行了纯化又将其划分为糖尿病变异体型（D 型）和非致糖尿病变异体型（B 型）两个亚型[14]。我国在 2005 年首次从病畜尸体中分离和鉴定出了 EMCV [12]，之后在多个地区也相继发现了与其同源性高达 90%的其它毒株[15-17]。目前为止，EMCV 根据来源可分为 Mengo 病毒、Maus-Elberield 病毒、小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler'smurine encephalaomyelitis virus，TMEV）和哥伦比亚 SK 病毒等[18,19]。根据临床症状又可将 EMCV 分为繁殖障碍型和脑心肌炎型，前者是导致怀孕母猪发生生殖障碍性疾病的主要原因，后者表现为脑炎、心肌炎及心肌周围炎[20,21]。
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2 热休克蛋白 27 的研究进展
2.1 HSPs 的起源及分类
热休克蛋白（Heat shock proteins, HSPs）是 20 世纪 80 年代在果蝇唾液腺中发现的一类广泛存在生物体内的可参与蛋白质折叠和成熟的宿主蛋白，其功能多样、结构高度保守[74]。当机体处于高温、炎症、缺血或氧化应激等状态时，HSPs 大量合成[75]。HSPs 主要分布于细胞质和细胞核中，可通过促进蛋白质二三级结构的形成参与修复或清除受损变性的蛋白质，并与细胞内信号传导、细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等发生密切相关[76]。HSPs 对非应激细胞具有独特的细胞保护机制，在应激细胞中表达从而保护宿主蛋白免受毒性物质的伤害。根据等电点和分子量的不同分为 HSP27、HSP40、HSP60、HSP72（HSPA1）、HSPA6、HSP90、HSP110、GRP170、HSC70（HSPA8）、mortalin（HSPA9）和 GRP78（HSPA5）等 11 种 HSP，其中后三种是组成性表达的[77,78]。除小分子 HSPs 外，其它热休克蛋白都是具有ATP 酶活性的 ATP 依赖性蛋白。热休克因子（HSF）是 HSPs 的诱导性转录调节因子，是大多数 HSPs 表达所必需的[76]。热休克元件（HSE）是位于热休克蛋白基因上游的顺式作用序列，热休克元件可以结合并诱导热休克蛋白基因的表达[79]。HSPs 通过调节血管生成、细胞增殖分化、迁移、侵袭和转移等过程中发挥作用[80]。此外，HSPs 还可参与细胞凋亡及调控某些抗癌药物的耐药性，故而可用于肿瘤诊断和药物治疗靶点。
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第二章 EMCV 对 HSP27 表达的影响
1实验方法
1.1 细胞的复苏和培养
从液氮罐中取出冻存的 A549 细胞和 BHK21 细胞，将其置于 40℃左右的温水中快速晃动细胞使其溶解。将溶解后的细胞置于离心机中 950rpm 离心 5~10min，弃去细胞冻存液，用 1mL 含 15%NBS 的 RIPM1640 培养基重悬细胞后，转入 T35细胞瓶中，向细胞瓶中补加 7mL 左右的 15%NBS RIPM1640 培养基，拧紧瓶盖后轻轻晃动瓶身使细胞均匀分布于培养液中，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。第二天观察细胞生长状态，若培养基中存在较多的死细胞时，需更换新的培养液。实验方法2.1 细胞的复苏和培养从液氮罐中取出冻存的 A549 细胞和 BHK21 细胞，将其置于 40℃左右的温水中快速晃动细胞使其溶解。将溶解后的细胞置于离心机中 950rpm 离心 5~10min，弃去细胞冻存液，用 1mL 含 15%NBS 的 RIPM1640 培养基重悬细胞后，转入 T35细胞瓶中，向细胞瓶中补加 7mL 左右的 15%NBS RIPM1640 培养基，拧紧瓶盖后轻轻晃动瓶身使细胞均匀分布于培养液中，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养。第二天观察细胞生长状态，若培养基中存在较多的死细胞时，需更换新的培养液。
提前一天将处于对数生长期的 A549 细胞接种于 6 孔细胞培养板中培养。待细胞密度达到 90%左右时，接种 0.01MOI 的 EMCV。分别在接毒 0h、3h、6h、9h、12h 和 24h 后将细胞用胰酶消化后，用 1mL1× PBS 吹悬细胞，将细胞悬液转移至 1.5mLEP 管中，于 950rpm 离心机中离心 10min，所得沉淀即细胞。一组 WesternBlot 检测 HSPs 家族成员 HSP90β、HSP70、GRP78、HSP27 及病毒结构蛋白 VP1表达量的变化。Western Blot 具体方法是将收取的细胞置于冰上，向其中加入 200μL细胞裂解液（PMSF：RIPA=1：100）裂解 20min 左右，期间每隔 5min 弹打一次细胞使其充分裂解，于 4℃，12000g 离心 30min，收集上清液，用 BCA 蛋白定量试剂盒定量后，取适量向其中加入 5×SDS Loading Buffer，于 95℃沸水中煮 5min。以每孔 40μg 的上样量进行蛋白电泳，电泳结束后使用半干转转膜仪进行转膜（转膜条件为 1A，15V，45min）。转膜完成后，使用 3%的脱脂奶粉封闭 1h，弃掉封闭液分别加入目的蛋白的一抗（HSP27、GAPDH、HSP70、GRP78 及 HSP90β的抗体），4℃孵育过夜，用 1×TBST 在脱色摇床上洗膜 5 次，每次 5min。加入 HRP标记的山羊抗兔或山羊抗鼠 IgG 室温摇床孵育 1h 后，洗膜 5 次在凝胶成像系统中进行 ECL 化学发光显色。另一组用 RT-qPCR 检测 HSP27 的基因转录水平。具体步骤是提取所收取的细胞总 RNA，用酶标仪测定 RNA 浓度及 OD260/280，然后以 1 μg 的 RNA 总量进行反转录，体系如表 2-2 所示。
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2实验结果
2.1 EMCV 感染对 HSP27 表达的影响
2.1.1 A549 细胞不同时间段接毒 HSPs 表达量的变化
在 A549 细胞中，Western Blot 检测结果发现 EMCV 感染对热休克蛋白家族成员 HSP90β、HSP70、GRP78 的表达影响均不明显，但可明显下调 HSP27 的表达，且随着病毒感染时间和滴度的增加，HSP27 蛋白表达的下降趋势愈发明显（如图 2-1A，图 2-1B），但其不影响 HSP27 的基因转录（图 2-1C）。
图 2-1 EMCV 感染对热休克蛋白表达的影响
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第三章 HSP27 对 EMCV 增殖的影响.......................19
1 材料及仪器设备......................... 19
1.1 主要材料........................................ 19
1.2 主要试剂............................................. 19
第四章 HSP27 对Ⅰ型 IFN 信号通路的影响.............................................32
1 材料及仪器设备.............................. 32
1.1 主要材料...................................... 32
1.2 主要试剂...................
