第五章 HSP27 对炎性因子及其通路相关蛋白表达的影响..................51
1 材料及仪器设备................................... 51
1.1 主要材料........................ 51
1.2 主要试剂............................. 51
第五章 HSP27 对炎性因子及其通路相关蛋白表达的影响
1 实验方法
1.1 上调 HSP27 对炎性因子及其信号通路相关蛋白表达的影响
将生长状态较好的 A549 细胞传代至 6 孔板中培养。待细胞汇合度为 80%左右时，向无菌的 EP 管中分别加入 250μL 转染用 Opti-MEM，其中一组中加入 500ng或 1000ng 的重组质粒 pCMV-Myc-HSP27 或空载质粒 pCMV-Myc，另一组中加入5μL 脂质体 2000，混合静置 5min，然后将混合静置 20min，期间用 PBS 洗两次细胞。然后将 500μL 的转染混合液加入对应的孔中，将孔板置于 37℃培养箱中培养，转染后 6h 换液，弃去转染液，加入 2mL RIPM1640 培养基继续置于 37℃培养箱中培养。转染 36h 后，接种 0.01MOI 的 EMCV，待细胞 CPE 初见端倪时，收集细胞，一组进行 Western Blot 检测炎性因子及其通路相关蛋白的表达情况，另一组用RT-qPCR 检测炎性因子及其通路相关蛋白的表达情况，首先提取细胞总 RNA，将其反转录为 cD NA。按照染料说明书进行操作，具体反应体系如下（总体积 20μL）：TransStart Top Green qPCR SuperMix （2×） 10μL，ROX 校准液 0.4μL，上下游引物各 0.4μL，DEPC H2O 6.8μL，模板（cD NA）2μL。按照 ABI 7500 荧光定量仪器操作设置程序，反应条件为 95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，共进行 40 个循环，所涉及的荧光定量引物序列见表 5-1，具体步骤参照第二章中的 2.2.1。
表 5-1 荧光定量引物序列
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第六章 全文总结
1. 在 A549 细胞中，EMCV 病毒蛋白 2C 和 3A 可通过自噬溶酶体途径降解 HSP27，并与 HSP27 相互作用共定位于胞质。
2.上调 HSP27 可显著抑制 EMCV 增殖；下调 HSP27 可显著促进 EMCV 增殖，表明 HSP27 在 EMCV 体外增殖中发挥负调控作用。
3. HSP27 可通过与 RIG-Ⅰ、MDA5 和 IRF3 直接相互作用，并促进 RIG-Ⅰ、MDA5和 IRF3 表达和 IRF3 的入核来正向调控Ⅰ型 IFN 信号通路的活化，进而促进宿主细胞的抗病毒反应。
4. HSP27 有助于 EMCV 病毒感染过程中炎性因子及其通路相关蛋白蛋白的表达，并且 HSP27 可以明显促进核因子 NF-κB 亚基 p65 的入核。
参考文献（略）
