本文是一篇医学论文发表,本课题首先以浓缩马铃薯蛋白为原料,分别通过五种蛋白酶:碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶以最适条件进行水解,以水解度为指标,用水解度为 29.28 %的风味蛋白酶作为目标酶将马铃薯蛋白水解,在其单因素试验结果的基础上,进行响应面优化,得到最佳酶解条件:温度 50 ℃、pH 6.2、E/S 24000:1 U/g,制得马铃薯蛋白水解液后从功能特性、分子量分布、游离氨基酸含量和肽段序列等方面,验证了马铃薯蛋白经过风味蛋白酶酶解之后得到的产物中含有大量小肽物,将水解物经过 5 kD 的超滤膜得到马铃薯蛋白精制水解液(PPH)冻干保存。
第 1 章 文献综述
1.1 引言
马铃薯是我国重要的农产品,也是主要能量来源的食物之一。马铃薯具有诸多功效,如和胃调中、强身益肾、消肿等,还可辅助治疗消化不良、神疲乏力、慢性胃病等症状[1]。马铃薯中的直链淀粉较多,它适用于加工淀粉类食品。在马铃薯淀粉加工会产生大量的工艺废水[2],其中含有马铃薯蛋白 0.9 %~2.1 %,将其直接排污,浪费了其中的蛋白。目前,很多研究方向是将废水中的蛋白加工利用,改善其功能特性,把它变成具有经济效益的产品,进一步拓宽马铃薯蛋白的研究领域,以期实现马铃薯蛋白的资源化利用[3],是一种提高蛋白利用率的新途径。
目前,蛋白水解物在国内外生物领域研究的发展,已经渗透到生物制药、医药和基因工程等方面,较多研究是将水解物应用于细胞体外培育,生产生物制品[4]。随着对生物制品安全控制要求的不断提高,对生物制品工艺的要求也越来越高,技术的创新使得细胞培养体系越来越完善,细胞培养技术也越来越成熟。细胞培养作为工艺中的基础研究,培养基就成了关键问题[5]。为了改善和降低细胞培养基中血清成分带来高成本的污染风险问题,利用无动物源性成分添加至培养基,开发无血清或低血清培养基是目前细胞培养领域中研究的一大热点,在更多研究报道中发现[6, 7],生产中大部分应用的是植物蛋白水解物添加至细胞培养基,可使细胞的培养环境发生改变,改善生长状况,并可作为细胞培养的辅助物质应用于贴壁和悬浮细胞,在细胞培养技术领域发挥了重要作用。
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1.2 马铃薯和马铃薯蛋白概况
1.2.1 马铃薯概况
马铃薯(Solanum tuberosum L)又名土豆、 洋芋、洋番薯等,茄科茄属一年生草本植物,是仅次于小麦、玉米和水稻的世界第四大粮食作物[8]。马铃薯富含蛋白质、多种矿物质和维生素,早已成为食用蛋白质的重要来源之一。目前植物源性蛋白的开发利用已引起世界各国的关注[9],而马铃薯日益受到世界重视。
中国是马铃薯生产大国,据国家统计局公布,2019 年我国马铃薯产量达 1769万吨。马铃薯和其他谷物作物相比,营养丰富,物美价廉,蛋白质和淀粉含量极其丰富。马铃薯中可以区分三种主要的蛋白质组:马铃薯块茎蛋白,蛋白酶抑制剂,以及其他分子量较高的蛋白质[10],每 100 g 的鲜马铃薯含有 1.5~2.3 g 蛋白质,由 19 种氨基酸组成,必需氨基酸含量为 20.13 %,占氨基酸总量的 47.9 %[2],其中缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸含量较高,尤其赖氨酸含量远高于各类蛋白中的含量,其营养仅略次于鸡蛋蛋白接近动物性蛋白[11]。据估算,马铃薯的蛋白质利用价值约 71 %,比其他谷物高 21 %;富含钙、磷、锌、铁、钾及多种核苷酸,VC等,而且马铃薯被列为 VC 的主要食物来源之一[12]。同时马铃薯中淀粉含量占11~20 %,适用于生产淀粉类食品,马铃薯高值化利用最重要的途径即为马铃薯淀粉的提取。我国每年约有 300 万吨马铃薯原料用作淀粉生产,在淀粉生产中附带大量的副产品,同时会产生大量富含蛋白质的废水,其中蛋白质含量为 0.9 %~2.1 %[13]。目前,这类马铃薯蛋白没有得到有效的回收利用,而是作为工业废水通过生化处理池进行废水处理排放。如果将废水中的蛋白质进行回收并高值化利用,产生一定的经济效益的同时还能有效降低废水中的有机物含量,为后续的污水处理降低难度[14]。
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第 2 章 基于响应面法优化马铃薯蛋白水解工艺
2.1 材料和仪器
2.1.1 材料
实验主要材料如表 2-1
表 2-1 实验材料
2.1.2 主要仪器设备
主要仪器设备如表 2-2。
表 2-2 实验仪器设备
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2.2 方法
2.2.1 马铃薯蛋白水解物的制备
(1)筛酶试验
配制 8 %的马铃薯蛋白质溶液,调节 pH 至酶的最适值,分别按 1:6 比例加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶,在各酶最佳的温度条件下水解相同的时间,90 ℃水浴灭活酶 15 min。计算并比较各酶的水解度,筛选出水解度最高的酶。表 2-3 为各酶反应的参考条件。
表 2-3 5 种酶参考反应条件
(2)单因素试验
研究不同的酶解时间、温度、pH 和酶与底物比( E/S) 对水解度(DH)的影响,确定各水解因素的最佳水解条件。
①时间对水解度的影响
单因素实验中,每组实验底物浓度均为 8 %,充分溶解后以 E/S=25000:1(U/g)加入蛋白酶进行酶解,调节 pH 至 7.5,反应温度为 55℃,以反应时间 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 作为试验组,反应结束后 90℃水浴灭活,测定不同时间酶解液的水解度,确定最佳反应时间。
②温度对水解度的影响
单因素实验中,每组实验底物浓度均为 8 %,待充分溶解后以 E/S=25000:1(U/g)加入蛋白酶进行酶解,调节 pH 至 7.5,以反应温度 45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃作为试验组,以试验①中确定的最佳水解时间进行酶解,反应结束后 90 ℃水浴灭活,测定不同温度酶解液的水解度,确定最佳反应温度。
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第 3 章 马铃薯蛋白水解物的特性研究...................30
3.1 材料和仪器..................30
3.1.1 材料..................30
3.1.2 主要仪器设备..................30
第 4 章 马铃薯蛋白水解物对 MDCK 贴壁细胞增殖的影响..............43
4.1 实验材料.......................43
4.1.1 材料.......................43
4.1.2 主要仪器设备.....................43
第 4 章 马铃薯蛋白水解物对 MDCK 贴壁细胞增殖的影响
4.1 实验材料
4.1.1 材料
实验主要材料如表 4-1
表 4-1 实验材料
取冻存于液氮罐中的犬肾细胞(MDCK)贴壁细胞两支,于 37 ℃的水中晃动使其快速溶解后在 1000 rpm/min 下离心 5 min,无菌操作下接种于 T25 细胞瓶,加入 10 mL 含 10 %新生牛血清(NBS)的 DMEM 培养基,置于 37 ℃、CO2恒温培养箱,待 8-10 h 细胞贴壁后更换细胞培养液,培养 48h 后消化计数并传代。稳定传代待细胞适应后进行后续实验。
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全文总结
本课题首先以浓缩马铃薯蛋白为原料,分别通过五种蛋白酶:碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶以最适条件进行水解,以水解度为指标,用水解度为 29.28 %的风味蛋白酶作为目标酶将马铃薯蛋白水解,在其单因素试验结果的基础上,进行响应面优化,得到最佳酶解条件:温度 50 ℃、pH 6.2、E/S 24000:1 U/g,制得马铃薯蛋白水解液后从功能特性、分子量分布、游离氨基酸含量和肽段序列等方面,验证了马铃薯蛋白经过风味蛋白酶酶解之后得到的产物中含有大量小肽物,将水解物经过 5 kD 的超滤膜得到马铃薯蛋白精制水解液(PPH)冻干保存。
其次,经过水解后 PPH 的起泡性和溶解性均有所提高;在氨基酸含量测定中,PPH 中含有 24 种氨基酸,总量高达 38.44 %,其中必需氨基酸占 13.22 %,支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸和异亮氨基酸)占 8.54 %;在分子量分布测定中,综合电泳、HPLC 和质谱鉴定,结果表明 PPH 中的蛋白质已被充分水解,分子量大小范围在 17 kD 以下,且平均分子量为 997 D 的组分是占比最高的组分,约占 64 %。
最后,利用体外细胞培养,研究不同分子量的马铃薯蛋白水解物在 MDCK细胞中的应用。结果表明:PPH 对 MDCK 贴壁细胞培养具有促进作用,根据细胞生长曲线、细胞贴壁率和克隆率、细胞生化代谢分析,说明本研究制备的 PPH添加至低血清培养基,细胞代谢方式发生变化物质,且说明该水解物含有能供细胞吸收的物质,可替代 MDCK 细胞培养基中的部分血清进行细胞培养;在对 PPH在细胞冻存中的效果评价中,将添加水解物培养的 MDCK 细胞以 2×106 cell·mL-1的密度冻存一周后复苏发现细胞能正常生长传代并且细胞形态良好;替代部分血清将 PPH 分别以不同浓度加入细胞冻存液复苏后,发现 MDCK 贴壁细胞可正常冻存及对细胞有保护作用,能替代