摘要 为建立基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法,探讨其临床应用价值,用PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464~2 980 nt段,并克隆入pMD18-T载体用作参比模板,设计一对引物和一个TaqMan-MGB探针,优化反应条件,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,并运用该系统同时应用连接酶链式反应(LCR)法对临床标本进行检测.结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,最低检测限度为1 DNA拷贝每反应;在100~109DNA拷贝每反应范围内,Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)和DNA拷贝数呈线性关系(r>0•990);对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.以上结果表明,所建立的基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)引起的泌尿生殖道感染,目前已成为常见的性传播疾病,并可导致输卵管炎、盆腔炎和不孕等严重的后果.尤其是无症状或症状轻微的感染者,由于未得到广泛的重视和彻底治疗,使得新的感染人群不断扩大.因此对沙眼衣原体感染进行快速、灵敏、准确的诊断,不仅可限制疾病的传播,而且可减少不良后果的发生.近年来鉴别沙眼衣原体的金标准一直是培养法,尽管该方法特异性高,但检测程序费时费力,不适于沙眼衣原体的大规模筛选.免疫技术也存在敏感性较低,判断结果受主观因素影响较大等不足. PCR是近年来迅速发展起来的DNA检测技术,可以通过扩增沙眼衣原体内含有的质粒或染色体基因组DNA达到诊断目的,具有敏感、快速等特点,但目前常规PCR应用于基因诊断仍有许多局限性,主要有两点,一是不能准确定量,二是由于太灵敏,容易交叉污染,易产生假阳性.尽管为了克服上述不足,人们采取了许多方法,如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等,但均不很成功,直到最近实时荧光定量PCR技术的出现才使上述问题得到较好的解决.近年来的文献报道[1~5]显示,实时荧光定量PCR技术是目前最准确、重现性最好并得到国际公认的核酸分子定量和定性检测标准方法. TaqMan-MGB探针为近期出现的新一代TaqMan探针,其在实验结果的精确性、重复性、杂交特异性等方面均优于常规TaqMan探针.本文运用TaqMan-MGB探针,进行了建立新型沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统的探讨.
1 材料和方法
1•1 材料1•1•1 临床标本:可疑标本50例来自西京医院皮肤科门诊,取材时,应将无菌拭子插入男性尿道3~4 cm,用力擦取;女性需先清洁宫颈鳞柱状上皮,然后将拭子或细胞刷伸入宫颈管内1~2 cm,放置1~2 min并转动,作宫颈管内细胞取材.1•1•2 仪器: DNA Engine OpticonTM全自动荧光定量PCR仪购自MJ Research公司.1•1•3 试剂:热启动Taq酶、dNTPs、限制性内切酶PstⅠ、EcoRⅠ、X-gal、IPTG和pMD18-T载体连接系统购自TAKARA公司. PCR产物纯化试剂盒购自Invitrogen公司,质粒提取试剂盒购自Promega公司.1•2 方法1•2•1 标本处理:拭子在1 ml生理盐水中挤压浸泡5 min后弃去,取500μl 8 000 r/min离心5 min,弃上清,在沉淀中加入800μl的生理盐水洗沉淀1次, 8 000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀溶入50μl处理液中(10 mmol/L Tris-HCl pH 7•8,5 mmol/L EDTA, 0•45% Tween-20, 50 mg/L蛋白酶K),充分混匀, 55℃温育1 h, 100℃煮沸10 min, 12 000 r/min离心5 min,取5μl上清作为PCR模板.1•2•2 连接酶链式反应(LCR)分析:按说明书进行(美国Abott公司).1•2•3 实时荧光定量PCR分析系统的建立:a•参比模板的构建.选择位于沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464~2 980 nt段为参比模板,PCR引物序列为5′GGACAAATCGTATCTCGG 3′和5′GAAACCAACTCTACGCTG 3′, PCR产物回收后克隆入pMD18-T载体.用PstⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定后进行序列测定.b•实时荧光PCR引物和MGB探针设计.除遵循引物设计的基本原则外, PCR引物和MGB探针的设计还应遵循以下几个基本原则:第一,扩增片段尽量短;第二,引物与探针之间的距离尽可能近,但引物不能与探针重叠;第三,探针的5′端第一个碱基不能是G;第四,引物的退火温度为58~60℃,探针的退火温度为68~70℃.定量检测用的引物和探针均位于参比模板内(图1).正向和反向引物序列分为5′TCAAATGACAAG-CTTAGATCCGTT 3′和5′GCGCTACACACGCT-CAAATC 3′,这对引物所扩增片段的大小为65 bp.荧光探针为5′FAM-TCATACGGTTTTCCTCG-MGB3′. TaqMan-MGB探针的工作原理.c•实时荧光PCR反应系统相关参数确定.关于实时荧光PCR循环参数及反应中引物和探针的比例等问题,文献报道各异,我们在总结文献报道的基础上,以标准曲线的相关系数及检测灵敏度为准绳,反复试验以建立最佳实时荧光PCR反应系统. PCR反应的前3~15个循环的荧光信号作为荧光本底信号.扩增和检测均在全自动荧光定量仪DNA Engine OpticonTM上进行.d•实时荧光PCR反应系统敏感性测试及线性标准曲线绘制.参比模板重组质粒纯化后,于紫外分光光度计上进行定量,根据重组质粒的碱基长度计算其分子质量,根据其分子质量计算其浓度,进而计算出每毫升所含的拷贝数.分级10倍稀释至2×102拷贝/ml,分别取5μl用作荧光定量PCR参比模板.在PCR的过程中由实时荧光定量PCR仪DNA Engine OpticonTM自动绘制线性标准曲线.1•2•4 实时荧光PCR反应系统的临床标本验证:对所收集的50例临床标本进行荧光定量PCR分析.
2 结 果
2•1 参比模板重组质粒序列测定及序列分析经在线序列相似性分析,所克隆序列同沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464~2 980 nt段序列有97%的同源性(505/517=97%).2•2 LCR对所收集的50例临床标本进行LCR分析,结果有27例为沙眼衣原体阳性.2•3 实时荧光PCR反应系统相关参数确定经反复试验所建立的反应系统为:反应体系50μl,引物和探针浓度均为0•4μmol/L, dNTPs浓度为0•2 mmol/L, MgCl2浓度3•5 mmol/L,热启动Taq酶1•25 U.参比品和待测样品各加5μl用作PCR模板.反应参数为: 94℃预变性180 s,然后95℃变性20 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸20 s,循环50次,最后37℃保温120 s.在每一循环60℃退火步骤读取荧光信号.2•4 最低检测限度所建立的实时荧光PCR反应系统的检测最低限度为1 DNA拷贝每反应.2•5 线性检测范围在100~109DNA拷贝每反应范围内,Ct值(threshold cycle,每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)和DNA拷贝数呈线性关系(r>0•990).2•6 临床标本荧光定量PCR检测结果对所收集的50例临床标本进行荧光定量PCR分析,结果有27例为沙眼衣原体阳性.检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.
3 讨 论
近年来的文献报道显示,实时荧光定量PCR技术是目前最准确、重现性最好并得到国际公认的核酸分子定量定性检测的标准方法,已广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域[6~9].实时荧光定量PCR技术的基本原理是(图2), PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;随着PCR的进行,当引物延伸至探针位置时, Taq酶发挥其5′-3′外切活性将探针5′端的荧光分子从探针上切割下来,淬灭分子失去对荧光分子的淬灭作用,从而使荧光分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例.因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量.同常规PCR法相比,该方法除具有常规PCR的优点外,还具有以下几个优点:一是有效解决PCR污染问题,从配好PCR反应液到结果分析完成,整个过程均在单管中进行,且勿需打开管盖,避免了PCR产物对实验室的污染;二是自动化程度高, PCR反应及其后的结果分析均由计算机来完成;三是特异性更强,因为荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交,而且同时强烈依赖于靶模板的扩增,二者缺一不可,故不存在非特异性扩增现象;四是PCR反应的实时监控,由于传统定量方法都是终点检测,而终点检测在
