摘要:目的 探讨基于荧光共振能量转移的杂交探针熔解曲线的实验影响因素,优化此法检测基因的实验条件。方法 利用荧光共振能量转移的原理,设计检测人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因的荧光杂交探针,在熔解曲线模式下,设定不同模板量、Mg2+浓度,观察熔解曲线峰面积及其Tm值。结果 在设定的反应体系中,随着模板量从10 ng渐次上升至100 ng,熔解曲线峰面积亦逐渐增大;随着Mg2+终浓度的增加,峰面积也增加,而且熔解曲线的Tm值也呈升高趋势。结论 探针熔解曲线法准确、迅速、操作简单,在应用中应考虑到模板量及Mg2+浓度的影响以便获得理想的结果。
基于荧光共振能量转移(FRET)的杂交探针熔解曲线法是在缓慢升温的情况下,利用两条相互邻近(1~5 bp)的紧密结合于靶DNA片段的探针发生荧光共振能量转移,仪器对荧光信号进行实时在线监测。它是一种高效、快速、无交叉污染、无需PCR后手工操作的全程自动化分子诊断方法[1]。该方法既可用于基因突变检测,又可对待测样品中的DNA或RNA进行定量。我们应用此方法检测人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因,在不同实验条件下用LightCycler荧光定量PCR仪监测其荧光信号,旨在探讨实验条件对荧光共振能量转移的探针熔解曲线影响。
1 材料与方法
1.1 模板制备 取正常人外周血2.0 ml,EDTA抗凝,分离白细胞后用酚/氯仿法提取基因组DNA溶于TE缓冲液(pH8.0)中,置于-20℃保存。
1.2 主要仪器及试剂 LightCycler荧光PCR仪为Roche Molecular Biochemicals公司产品,dNTPs及TaqDNA聚合酶均购自Promega公司。
1.3 引物及探针 检测人G6PD基因的上游引物为5′-TGCTCTCCTGTTCTTCTGCC-3′、下游引物为5′-TAGGCATGGAGCAGGCACTT-3′;与该基因配对的供体荧光探针为5′-CATGATGATGAATATGTGTGTATCC-3′-FITC、受体荧光探针为5′-LC-Red640-ACTGATGGAAGGCATCGCCCTGGAAAAGCTC-3′-PHO。引物及探针均在上海申友生物技术公司合成。
1.4 探针熔解曲线法检测人G6PD基因 在LightCycler配套的毛细管内加入20μl反应体系:含基因组DNA、0.3μmol/L引物、0.2μmol/L供体荧光探针、0.5μmol/L受体荧光探针、10×PCR缓冲液2μl、MgCl2、1 UTaqDNA聚合酶。然后在LightCycler上进行扩增及熔解曲线分析,扩增前置95℃50 s预变性,扩增程序为95℃0 s、60℃5 s、72℃5 s,共45个循环,之后快速升温至95℃30 s,再快降至55℃30 s。最后按0.1℃/s的速度缓慢升至约80℃,在此过程中LightCycler自动监测荧光信号的变化,进行熔解曲线分析。
2 实验与结果
2.1 模板DNA的浓度及纯度 取20μl模板DNA加入980μl双蒸水中,混匀后分别在260 nm,280 nm下测定A值,分别为0.072及0.041,估计模板DNA浓度约为180 ng/μl,A260与A280之比为1.76,说明模板DNA较纯。2.2 模板浓度对熔解曲线峰面积的影响。2.3 Mg2+浓度对熔解曲线峰面积的影响。2.4 Mg2+浓度对熔解曲线Tm值的影响。
3 讨论
荧光杂交探针是使用两条探针来增强反应的特异性[2],两探针都与扩增产物杂交,供体探针与受体探针十分靠近(1~5 bp)。若靶序列与探针完全配对,结合就相对牢固(Tm值较高),否则不配对的情况就会使杂交体的熔解温度下降。根据熔解曲线的Tm值进行基因分型在国外已有很多报道[3-5]。影响探针杂交的因素有很多,除杂交体的长度、GC含量及错配碱基的数量外,杂交反应的温度、盐浓度等也直接影响杂交体的形成和稳定性[6]。在设计探针时这些因素都已有所考虑。本文着重研究影响杂交效率及杂交体稳定性的其他实验条件,我们发现在一定限度内,当探针浓度固定时荧光探针熔解曲线峰面积与靶基因浓度呈正比(若不考虑非特异扩增或探针的非特异结合的影响,峰面积在一定程度上反映荧光信号的强度),如图1所示,这与Incyte公司在芯片杂交实验的结果一致[7]。图2及图3均显示随着Mg2+浓度增加,荧光信号也增加,峰高也增加,说明Mg2+浓度直接影响着靶序列与探针结合的效率。值得注意的是,当Mg2+浓度超过5.0 mmol/L时,峰面积增加并不明显,反而峰高下降,峰宽增加,可见Mg2+浓度并不是愈高愈好,我们认为将Mg2+浓度限定在2.5 mmol/L~5.0 mmol/L之间较合适。杂交体的稳定性决定了熔解曲线的Tm值,实验结果发现Mg2+浓度对其有一定影响,因此,Mg2+浓度不仅影响探针的杂交效率,它还影响杂交体的稳定性。当然,探针的浓度及杂交反应的温度也影响着杂交反应的效率,这在固相杂交反应中已得到证实。本实验表明靶基因浓度在一定范围内(本文为50ng)对熔解曲线的Tm影响不大。通过图2和图3的比较分析中发现,当模板DNA量为50 ng及100 ng时,即使Mg2+浓度相同,熔解曲线的Tm值也有轻度改变,可能的原因是:①探针与模板的比例影响了探针的结合效率。②不排除管间PCR特异扩增效率的差异。所以应用荧光杂交探针的熔解曲线法进行基因分型时,所有反应体系中Mg2+浓度及模板与探针比例应严格控制一致。总之,在使用荧光杂交探针的熔解曲线分析时,除了探针设计这一关键外,要得到理想的检测结果,实验条件的优化也十分重要,特别是Mg2+浓度与模板/探针浓度。
参考文献:
[1]Wittwer C,Rirle K,Andrew R,et al.The LightCycler:a microvolumemultisample fluorometer with rapid temperature control [ J ].Biotechniques,1997,22(1):176-181.
[2]Wittwer C,Herrmann M G,Moss A A,et al.Continuous fluorescencemonitoring of rapid cycle DNA amplification[J].Biotechniques,1997,22(1):131-1,134-8.
[3] Cane P A, Cook P, Ratcliffe D,et al.Use of real-time PCR andfluorimetry to detect lamivudine resistance-associated mutations inhepatitis B virus[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(7):1600-1608.
