新型MGB探针在沙眼衣原体实时PCR检测中的应用

靶模板浓度较高时结果并不真实(图3),实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果;五是绝对定量,由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行绝对定量测定.已出现的荧光定量PCR方法有多种,其中最有应用前景的方法是TaqMan探针法.目前新一代的TaqMan探针TaqMan-MGB探针已问世(Roche、Epoch). MGB是个三肽,其英文全称为Minor Groove Binder (小型的凹槽结合物),它可以结合在DNA双螺旋的小沟里,从而起到稳定DNA双螺旋的作用.同常规TaqMan探针相比,TaqMan-MGB探针具有如下优点:一是荧光本底低. TaqMan-MGB探针3′端标记了自身不发光的淬灭荧光分子,以取代常规可发光的Tamra荧光标记,这一新技术使荧光本底降低.二是分辨率更高.淬灭荧光分子与报告基团在空间位置上更接近,使实验的结果更精确,分辨率更高.三是杂交特异性增强.由于探针3′端另结合了Minor groovebinder结合物,使得探针的Tm值提高,大大增加了探针的杂交稳定性,提高了配对与非配对模板间的Tm值差异,使非特异性杂交显著降低.四是探针长度缩短.常规TaqMan探针在AT碱基含量较多时其探针长度将达30 ~ 40个碱基,而用TaqMan MGB荧光探针,探针长度一般在13~18个碱基范围内.这一特点对AT含量高的序列探针的设计有很大的帮助[10].鉴于上述原因,在检测性能方面,基于TaqMan-MGB探针的荧光定量PCR反应系统,应优于基于TaqMan探针的荧光定量PCR反应系统.我们在实验中也证实了这一点.前者敏感度高,检测限度为1 DNA拷贝每反应,而后者多达不到该检测限度.另外,前者检测线性范围广,在100~109DNA拷贝每反应范围内,Ct值和DNA拷贝数呈线性关系(r>0•990),而后者线性检测范围多在101