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木霉菌内生病毒鉴定及生物学功能探讨

日期:2021年11月21日 编辑:ad201107111759308692 作者:无忧论文网 点击次数:605
论文价格:150元/篇 论文编号:lw202111031921587918 论文字数:43666 所属栏目:农业管理论文
论文地区:中国 论文语种:中文 论文用途:硕士毕业论文 Master Thesis
相关标签:农业管理论文

本文是一篇农业管理论文, 在本研究通过对 120 株木霉菌提取 dsRNA 进行筛选,利用分子生物学方法及宏基因组学法发掘,最终获得 3 株疑似含有 dsRNA 内生病毒的木霉菌株,分别为哈茨木霉 T673( CTCCSJ-G-HB40673 )、 橘 绿 木 霉 T703 ( CTCCSJ-F-KZ40703 ) 和 橘 绿 木 霉 T827(CTCCSJ-F-KZ40827)。


第一章  绪论


1.1 木霉菌

木霉属真菌门,丝孢纲,丝孢目,有性生殖阶段为肉座目,肉座科,种类超过  250 种(JUáREZ-HERNáNDEZ et al., 2017; CAI and DRUZHININA, 2021),在土壤、空气和植物体表面等生态环境中大量分布(LIU  et  al.,  2017)。自 1932 年发现木霉具有拮抗作用以来,木霉菌的研究得到了深入发展和木霉菌的应用也更加广泛(宋维霞, 2014;  刘晨晨, 2019)。

1.1.1 木霉菌的分类

对木霉属真菌的最早描述可追溯到 1794 年,从 18 世纪后期真菌的正式分类学记录开始,并在 1865 年提出了与 Hypocrea 菌种性态的联系,木霉菌属中普遍存在的真菌营养和植物腐生真菌,直到1969年才开始发展识别概念,1984年Bissett将木霉属分为5个组:木霉组(sect. Trichoderma)、长枝木霉组(sect. Longibachiatum)、粗梗组(sect. Pachybasium)、肉座组(sect. Hypocreanum)及土星孢木霉组(sect.  Saturnisporum),并描述了 27 个木霉种(BISSETT,  1984)。到 2006 年,木霉菌已包含 100 多个系统发育定义的属。与其他常见真菌类似,过去二十年,随着分子生物学的普及以及木霉菌在人们生活中占据的地位的提高,木霉菌急剧转变为物种丰富的属( DRUZHININA  et  al.,  2006;  ATANASOVA  et  al.,  2013;  BISSETT  et  al.,  2015;  CAI  and DRUZHININA, 2021),目前,已知的木霉菌有  250  余种(秦文韬  等, 2016),生防制剂中应用最为广泛以哈茨木霉、深绿木霉和绿色木霉等为主(张成  等, 2021)。

1.1.2 木霉菌的生防特性 

随着对木霉菌研究的深入,木霉菌优异的生防性能也被更好的熟知和利用。一些木霉菌菌株能够为植物提供营养和激素。另一些则改变植物内部激素的稳态、加强光合作用和碳水化合物的代谢。木霉菌的生防机制大致体现在四个方面。

一、代谢物的杀菌作用。木霉菌能产生多种抗生物质,且极具优势,能产生 70 种以上的代谢产物以抵抗真菌病害的侵染。其大部分依靠分泌特殊代谢物来抑制病原微生物的增殖,例如 6-戊烷基-α-吡喃酮(6-penthyl-α-pyrone)、阿拉霉素(alamethicins)、harzianic acid 等(HUANG et al., 1996; IIDA et al., 1995; STOPPACHER et al., 2010)。

二、胞外酶溶菌作用。木霉菌产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶在植物对病原真菌的抗性中起重要作用(叶小波  等,  2009),通过水解植物病原真菌的细胞壁,来抑制病原菌孢子萌发,引起其死亡。

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1.2 真菌病毒的研究进展

1.2.1 真菌病毒

真菌病毒(Mycovirus)是一类能够侵染真菌,并在寄主体内进行扩增的病毒。约有 100 种真菌可被病毒感染,其中包括几种病毒同时感染同一种真菌与一种病毒侵染几种真菌(时婷婷  等, 2015)。据目前的报道表明,在真菌和内生病毒之间存在着极为复杂的关系,真菌内生病毒在遗传学和分子生物学的研究中拥有巨大潜在价值(傅国和李宁毅, 2003)。部分真菌病毒侵染寄主后,可以使寄主真菌的致病力显著下降,从而产生致病菌弱毒株(GHABRIAL and SUZUKI, 2009)。因此,研究寄主真菌中真菌病毒的作用机理,对运用生物防治手段来防治农作物真菌病害具有重要意义。

真菌病毒的首次被发现是在 1948 年,宾夕法尼亚州的一个蘑菇场报道了一种危害栽培蘑菇的重要经济病害,其危害特征是双孢蘑菇子实体畸形,产量损失严重。真菌病毒的首次报道是在1962 年,Hollings 指出在患病的蘑菇孢子体中至少存在三种病毒颗粒(HOLLINGS and M., 1962),首次对真菌病毒进行了报道真菌病毒的分类依据是病毒基因组组成及复制方式。真菌病毒的定名是在 1986 年,Buck 发现以分枝病毒为来源的 dsRNA 对几种青霉培养滤液的干扰素诱导活性起作用(BUCK, 1986),这极大地促进了对真菌病毒的寻找。至今,报道表明真菌病毒在多种真菌中被发现,比如木霉菌(Trichoderma spp.)(LIU et al., 2019b)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) (AI et al., 2016)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)(LINDER-BASSO et al., 2005)、镰刀菌属真菌(Fusarium spp.)(LI et al., 2019)、稻曲菌(Ustilaginoidea virens)(ZHU et al., 2015)、白纹羽病菌 (Rosellinia necatrix) (KONDO et al., 2013)、葡萄孢属真菌(Botrytis spp.) (PEARSON and  BAILEY,  2013)和立枯丝核菌(Rhizoctonia  solani)(BARTHOLOMäUS  et  al.,  2016,  2017; MARZANO et al., 2016)。

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第二章  木霉菌内生病毒的初步发掘


2.1 实验材料

2.1.1 供试菌株

本实验室木霉菌资源库中菌株。

2.1.2 实验试剂

Glucose、Potato、Agar、DEPC(Diethyl pyrocarbonate)、CF-11 cellulose、Disodium hydrogen phosphate、Glycine、Trimethylol aminomethane(Tris)、Sodium hydroxide、SDS(Sodium dodecyl sulfate)、Sodium chloride、Chloroform、Isoamyl alcohol、Anhydrous ethanol、Phenol、NaAc·3H2O(Sodium acetate trihydrate)。

Recombinant DNase Ι、S1 Nuclease、PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaK aRa Ex Taq™(Takara)。

2.1.3 实验仪器

Constant  temperature  shaker(培英)、High  temperature  sterilizing  oven(三洋 LS-50HD)、Analytical  balance(METTLER  TOLEDO)、PH  measuring  instrument(METTLER  TOLEDO)、Electrophoresis apparatus(Bio-Rad)、Grinding Mill(RETSCH-MM400)、Mould Cultivation Cabinet(精宏 MJP-250)、Super-clean worktable(哈东联)、Cryogenic centrifuge(BECKMAN COΜLTER)、Rubber running instrument(六一 DYY-6C 型)、Ultraviolet gel imager(SAGECREATION)、医用低温保存箱(Haier DW-86W100)、PCR  仪(BIO-RAD C1000TMThermal Cycler)

Conical flask、Funnel、Centrifuge tube、Mortar、Tinfoil、Disposable culture dish。

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2.2 实验方法

2.2.1 内生病毒的发掘

从本实验室木霉菌资源库中初步筛选出  120 株的木霉菌作为研究对象,在 28℃黑暗条件下PDA 平板上培养筛选的菌株至产孢,刮取菌丝至 2ml  离心管,液氮冷冻研磨,利用 CF-11 纤维素法进行 dsRNA 提取,参见(刘晨晨, 2019)。

提取结束后电泳检测是否含有特殊条带。若有特殊条带存在,用 Recombinant DNase Ι 和 S1 Nuclease 进