图 2-1 酶解体系
反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测特殊条带是否仍存在，若两种酶酶切后，dsRNA 条带仍存在，即可以进行宏转录组测序，将原始样品送至上海伯豪。
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第三章 内生病毒的基因组全序列测定与分析 ............................... 21
3.1 实验材料 .................................. 21
3.1.1 实验试剂 ................................. 21
3.1.2 试剂配制 .......................... 21
第四章 木霉菌内生病毒的生物学功能的研究 ................................ 32
4.1 实验材料 ......................................... 32
4.1.1 供试菌株 ........................................... 32
4.1.2 实验用引物 ......................... 32
第五章 结论 ......................... 57
第四章 木霉菌内生病毒的生物学功能的研究
4.1 实验材料
4.1.1 供试菌株
T. cf. harzianum T673（CTCCSJ-G-HB40673），T. cf. harzianum T809（CTCCSJ-F-KZ40809）。
4.1.2 实验用引物
利用 VECTOR-NT 软件根据病毒序列设计特异性引物，设计引物如下表，引物由北京擎科生物技术有限公司合成。
表 4-1 本实验所用引物
4.1.3 实验试剂
Sucrose、Ribavirin、Lysing Enzyme from Trichoderma（LETB）、Sodium chloride、Yeast extract、Casamino acids、Seven hydrated Magnesium Sulfate、Potassium chloride、Sodium nitrate、Ferrous sulfate、Dipotassium hydrogen phosphate、Corn starch、HCl、Tris-Hcl、CaCl2、PEG 4000、CMC（Sodium carboxymethyl cellulose）。
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第五章 结论
1. 在本研究通过对 120 株木霉菌提取 dsRNA 进行筛选，利用分子生物学方法及宏基因组学法发掘，最终获得 3 株疑似含有 dsRNA 内生病毒的木霉菌株，分别为哈茨木霉 T673（ CTCCSJ-G-HB40673 ）、 橘 绿 木 霉 T703 （ CTCCSJ-F-KZ40703 ） 和 橘 绿 木 霉 T827（CTCCSJ-F-KZ40827）。
2. 利用宏基因组测序与 RACE 技术完成了对哈茨木霉 CTCCSJ-G-HB40673 菌株所携内生病毒的基因组全序列测定，分析了该病毒的基因组结构，通过系统进化分析对该病毒进行了分类学归类。T673 内生病毒含有两条亚基因组结构，dsRNA1 序列全长 1693 bp，编码 RdRp，dsR NA2序列全长 1458bp，编码假定蛋白。系统进化分析表明 T673 所携内生病毒应为双分病毒科（Partitiviridae）一个新种，并将其命名为 Trichoderma Harzianum Partitivirus 2（ThPV2）。
3. 利用原生质体和利巴韦林相结合的方法实现对 ThP V2 的成功剔除，获得不携带病毒的菌株 T673-F。
4. T673 和 T673-F 菌株的生物学特性的比较表明，内生病毒 ThPV2 的存在对寄主菌株的生长速度，生物量有轻微的降低，ThPV2 的存在对菌株的产孢能力有明显的促进作用，即菌株 T673产孢量为菌株 T673-F 产孢浓度的 2.12 倍。携带病毒的菌株发酵液促进不携带病毒菌株产孢能力的试验表明，携带病毒的菌株或可产生某种物质能够提高不携病毒菌株的产孢能力。
5. 不携带病毒菌株与携病毒菌株的平板拮抗实验显示，内生病毒的存在对寄主菌株的拮抗能力影响虽然不大，但菌株 T673 对除立枯丝核菌之外的其他病原菌（尖孢镰刀菌黄瓜专化型、灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、辣椒疫霉菌、假禾谷镰刀菌）的抑菌率均高于菌株 T673-F。在内生病毒-木霉菌-黄瓜枯萎病菌的互作体系中，T673 和 T673-F 均具有抗病促生作用，其中 T673 较 T673-F对枯萎病的防效更明显，而 T673-F 较 T673 对黄瓜的促生能力更强，此外内生病毒介导木霉菌T673 促进黄瓜提前开花。紫甘蓝的大田试验数据表明不携带病毒菌株的促生能力更强，菌株T673-F 处理过的紫甘蓝植株比菌株 T673 处理过的植株叶包周长增加 15.03%，叶包直径增加24.18%。
本实验丰富了木霉菌内生病毒的资源库，为真菌病毒的分类提供了更多的资源。同时也为内生病毒-木霉菌-病原-植物四者互作机制、内生病毒促进木霉菌产孢机制、内生病毒促植物早熟机制研究奠定了坚实的基础。
参考文献（略）
