本文是一篇农业论文，本研究以中国农业科学院麻类研究所实验基地提供的工业大麻为原材料，以正己烷、乙酸乙酯、石油醚为提取溶剂，采用对倍稀释法测定工业大麻叶提取物对几种常见的菌株（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、黄曲霉菌）的抑菌活性，同时并以此为研究对象，以确定其抑菌活性、生长曲线、细胞膜完整性等其他指标；运用高效液相仪器对工业大麻叶提取物的有效抑菌成分进行测定；同时采用扫描电镜观察其对菌体超微结构的影响，以期获得工业大麻叶抑菌活性成分的特点及抑菌机理，为工业大麻叶的资源利用得到更广泛的开发而提供理论依据。
第一章 绪论
1.1 工业大麻简介及其用途
工业大麻（Cannabis sativa L.），通常称为大麻，线麻，亚麻，野生大麻等，属于大麻科（Cannabinaceae）工业大麻属（Cannabis）一年生草本植物，其大约有 150 个品种左右，且多为雌雄异株，叶如掌状，花大多都是单性异株：雌花簇生在叶腋中，花萼生长不明显，紧贴于子房一侧；雄花为圆锥花序，花萼处于分离状态。工业大麻易于种植，具有很强的适应环境的能力，适应环境能力强，易存活，一般茎高约 1～3 m，由于其适应性强分布广，后期变异幅度大，是一个适应环境的多样化群体(蒋少军 等，2005)。在不同的栽培条件下，工业大麻由于其极度多样化而分为两个亚种：一种是以利用工业大麻的生产纤维和油脂为目的，具有高而长的茎，这些植物主要栽于北方的原亚种；另一种是以工业大麻提取麻醉剂或者刺激剂为目的，一般具有茎短叶多为特点，主要栽于热带地区(高志勇 等，2006)。
工业大麻的应用价值广泛，主要分为传统应用和现代开发应用。传统应用主要是使用工业大麻的纤维材料，制作传统的天然材料：大麻纺织业应用中的衣物、床单、袜子等物品，因其具有透气好、质地软、抗菌等优点，深受人们的喜爱（吴建明 等，2010）；大麻饲料应用中的大麻茎秆和叶，以其抗菌、抗炎等防病功能，一直被广泛使用（姜黎 等，2012）；大麻造纸业应用中的烟卷、证券纸、人民币、纤维板、绝缘材料等，由于其良好的吸湿性，无污染，易降解等优点，已被广泛投入生产（郭丽 等，2014）。现代开发应用主要是利用工业大麻的活性成分及其基本化学组分，适用于现代的资源发展：大麻药业应用中酚类物质有较强的抗炎、缓解疼痛等速效治疗作用，同时医疗上不断地在开发提高其他活性成分的应用（魏月媛 等，2015）；大麻能源利用应用中的大麻种子油产品涉及多个领域，如化妆品、染料、润滑油、内燃机用油等（梁淑敏 等 2016）；大麻食用应用中大麻籽油因其富含氨基酸、脂肪酸、蛋白质等成分，应用于食用油、副食品、饮料等产品中（杨雪艳 等，2017）。
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1.2 工业大麻的化学成分及其研究现状
大麻含有非常多的天然化学成分。而关于工业大麻的化学成分研究，迄今为止，已有报道采用不同的提取工艺及分析技术，分离和鉴定出了 565 种化合物（FLORES-SANCHEZ I J et al., 2008），其中包括大麻素类和非大麻素类，同时通过生物活性特性研究发现，工业大麻具有很大的医学价值，具有抗肿瘤、止痛、抗类风湿、抗血压、抗血栓形成、抗菌抗炎等生物活性，具有巨大研究的潜力（戴志刚，2012）。
1.2.1 大麻素类物质
大麻素类物质是具有独特的 C12萜酚骨架的天然化合物。大麻素类物质是具有特有 C12萜酚骨架的天然化合物，以及由其衍生转化的次生代谢化合物，受到了人们的广泛关注 (APPENDINO G et al., 2008; HANUS L O et al., 2016)。目前，据文献报道大麻素化合物有 150 多种，而大麻素生物活性多样，相关报道称大麻素系统已被证明具有抗痛觉活性（YUN C et al., 2008）；也有报道大麻素 1 型受体（Cannabinoid type 1 receptor）与各种生理活动密切相关（如肥胖、血脂异常、高血压、疼痛和糖尿病）等多种生理活动紧密联系，并且参与调节多种神经递质的释放（李国旗，2017）。同时根据他们化学结构的差异可分为 11 个亚类：四氢大麻酚类(Tetrahydrocannabinol types，Δ9-THCs)、大麻萜酚类(cannabigerol types，CBGs)、大麻二酚类(cannabidioltypes，CBDs)、大麻环萜酚类(cannabichromene types，CBCs)、大麻酚类(cannabinol types, CBNs)、脱氢大麻二酚类(canna-binodiol types，CBNDs)、大麻环酚类(cannabicyclol types, CBLs)（田爱莹，2015；李俊 等，2020）。THC、CBD 等物质的化学成分研究及相关活性已经有相关文献报道(成亮 等，2008)。THC属于精神活性成分，用于治疗癌症中的严重呕吐现象、缓解疼痛、抗菌抗炎、抗氧化、降血压等作用（GRINSPOON et al., 1995；PUUPPONEN P R et al. 2010；杜军强，2011），但是因其有严重的精神致幻作用，一直被国家禁用；CBD 是大麻中一种非精神活性成分，具有缓解镇痛、润滑保湿、抗风湿关节炎及抗焦虑等近 50 种医药用途（FRANCO V et al., 2019）；CBDA 对神经系统疾病有一定的抗痛觉效应，已被证明对啮齿类动物恶心和焦虑的治疗有效（VIGLI D et al., 2020）；研究表明 CBDV（次大麻二酚，Cannabidivarol）在医药、营养和化妆品等方面的应用引起了科学界的极大兴趣，能够限制 THC 等精神活性和非法大麻素的生成（CHIURCHIU E et al ., 2021）；大麻酸和大麻酚对瘤细胞均能产生明显的抑制杀伤作用，（薛少安 等，1992）。总的来说，各种类型的大麻素类物质都极具相关研究开发的潜力，能最大化的增加大麻的药用价值和经济价值。
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第二章 工业大麻叶对细菌及真菌的抑制作用
2.1 材料与方法
2.1.1 化学试剂与实验材料
试剂：乙醇等均为工业级，被购于北京生化试剂公司，BCA 蛋白质定量试剂盒、AKP 检测试剂盒测试和 β-半乳糖苷酶活性试剂盒，均来自于南京建成生物工程研究所；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯葡萄糖肉汤培养基，均被购自海博生物技术有限公司。
实验材料：工业大麻叶 H1 选自中国农业科学院麻类研究所基地，45℃干燥粉碎，-20℃保存备用；黄曲霉菌（A.flavus）、蜡样芽孢杆菌（B.cereus），均被购自源叶生物公司，金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）由中国农业科学院麻类研究所提供。
2.1.2 主要仪器及设备
本章所用到的实验仪器、规格型号与生产厂家明细见表 2-1。
表 2-1 实验仪器
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2.2 结果与分析
2.2.1 工业大麻叶提取物对 4 种细菌的抑制效果
工业大麻叶提取物的抑菌圈直径可以反映菌株对工业大麻叶提取物的敏感程度，抑菌圈直径0～10.5 mm 为低度敏感、10.5～14.5 mm 为中度敏感、14.5 mm～20 mm 为高度敏感、20 mm 以上为极敏感、“－”代表未检出抑菌圈。由表 2-1 及图 2-1 的抑菌圈结果表明，工业大麻提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，抑菌圈直径大小分别为 15.57±1.65 mm、14.86±1.37 mm，并且随着工业大麻叶提取物浓度的降低，抑菌环明显变小，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为 6.25 mg/ml。但未检出工业大麻叶提取物对蜡样芽孢杆菌和黄曲霉菌的抑菌圈直径，不敏感，基本无抑制作用。以 70%的无水乙醇作为对照组，无抑菌圈出现，说明无法抑制菌株的生长。
表 2-2 工业大麻叶提取物对四种菌株的抑菌圈直径（mm）
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第三章 工业大麻叶提取物有效抑菌成分的筛选分离 ............................ 17
3.1 材料与方法 ........................................ 17
3.1.1 化学试剂与实验材料 ................................... 17
3.1.2 主要仪器和设备 ............................. 17
第四章 不同品种工业大麻叶提取物对大肠杆菌的抑制作用 .......................... 30
4.1 材料与方法 ........................................ 30
4.1.1 化学试剂与实验材料 ......................................... 30
4.1.2 主要仪器和设备 ...
